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关键词：
啤酒大麦,质量,控制
发表时间：
2012-12-26 10:38:08
与CYPOR共表达CYP2D6_1和CYP2D6_10及其代谢活性比较
杨丽君 | -> | 1766| 0| 1194.246MB |昆虫表达系统,细胞色素P450 2D6*1,细胞色素P450 2D6*10,细胞色素氧化还原酶,代谢差异
摘要: 细胞色素P450 2D6 (cytochrome P450 2D6, CYP2D6) 是一种重要的氧化代谢酶, 呈基因多态性, 对药物的代谢呈现明显的个体差异和种族差异, CYP2D6*10 在中国人群中的发生率高达51.3%。采用杆状病毒昆虫表达系统, 采用与细胞色素氧化还原酶 (cytochrome oxidoreductase, CYPOR) 共表达的方式获得具有代谢活性的CYP2D6*1/CYP2D6*10, 并初步研究其催化右美沙芬的代谢活性差异。构建重组质粒pFastBac-CYP2D6*1,pFastBac-CYP2D6*10 和pFastBac-CYPOR, 并分别转化DH10Bac 菌株构建重组Bacmid-CYPOR, Bacmid-CYP2D6*1 和Bacmid-CYP2D6*10, 转染Sf9 昆虫细胞, 获得重组杆状病毒用于病毒扩增和感染Sf9 昆虫细胞。通过测定混悬蛋白催化右美沙芬的速率来优化重组CYPOR 和CYP2D6 病毒感染Sf9 昆虫细胞的感染复数(multiplicity of infection, MOI) 值和其比例, 获得活力较高的重组CYP2D6*1 和CYP2D6*10。重组CYP2D6*1催化右美沙芬的Km 为 (26.67 ± 2.71) μmol·L−1 (n = 3), Vmax 为 (666.7 ± 56.78) pmol·nmol−1(CYP2D6)·min−1 (n = 3), 清除率为25.0; CYP2D6*10 催化右美沙芬的Km 为 (111.36 ± 10.89) μmol·L−1 (n = 3), Vmax 为 (222.2 ± 20.12) pmol·nmol−1(CYP2D6)·min−1 (n = 3), 清除率为2.0。利用杆状病毒昆虫细胞系统表达的重组CYP2D6*1 和CYP2D6*10 代谢药物具有活性差异, 可用于体外研究其催化某些药物的代谢差异, 这有助于理解药物代谢的个体差异、预测药物之间的相互作用。
药物在体内的生物转化有其相关的酶系, 由主要分布在肝脏中的CYP450 酶系进行I 相代谢转化。CYP450 是一组结构和功能相关的超基因家族编码的同工酶。在人类P450 超家族中, 主要有CYP1-3
三个家族酶系在体内参与外源性物质的转化, 其中CYP2D6 是一种重要的氧化代谢酶[1]。CYP2D6 在肝
中仅占CYP450 总含量的1%, 但可以催化抗心律失常药、β 受体阻断药、抗高血压药、三环类抗抑郁药
等30 多类药物的代谢[2], 发挥多种环境和生物毒素的解毒作用, 该酶在肝脏通过羟化等生物转化使这些药物和生物毒素等降解, 然后经肾脏排出[3]。因此CYP2D6 在药物毒理学和药代动力学等方面的研究受到广泛的重视。
药物代谢多态性可以引起病人间临床用药的疗效或毒性差异[4]。CYP2D6 基因位于22 号常染色体
上, 基因呈多态性, 约有70 多种等位基因突变体, 对药物的代谢呈现明显的个体差异和种族差异, 这是造成临床用药个体差异的主要原因。其中CYP2D6*10在中国人群中的发生率高达51.3%[3], 与CYP2D6*1比较, 氨基酸的相应变化是34 位Ser 变为Pro, 486位Thr 变为Ser。
CYPOR 是一个位于大多数细胞的核膜和内质网上的黄素蛋白, 它可以在还原型辅酶Ⅱ (NADPH)
与CYP450 之间传递电子。它是分子量约为78 kD的膜结合蛋白, 以黄素为辅基, 由一摩尔脱辅基蛋白
加上一摩尔黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavine-adenine dinucleotide, FAD) 和一摩尔黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide, FMN) 构成, 它的作用是在内部电子传递链中, 把电子从NADPH 传递到FAD 再到FMN,最后到细胞色素P450[5, 6]。
为了研究CYP2D6 及其突变体的活性差异, 本实验利用定点突变的方法将CYP2D6*10 变为CYP2D6*1, 在杆状病毒昆虫细胞表达系统中共表达了CYPOR 与CYP2D6*1/CYP2D6*10, 并用右美沙芬作为其底物测定了酶活性, 比较了CYP2D6*1 和CYP2D6*10 催化代谢右美沙芬的酶动力学差异。
三个家族酶系在体内参与外源性物质的转化, 其中CYP2D6 是一种重要的氧化代谢酶[1]。CYP2D6 在肝
中仅占CYP450 总含量的1%, 但可以催化抗心律失常药、β 受体阻断药、抗高血压药、三环类抗抑郁药
等30 多类药物的代谢[2], 发挥多种环境和生物毒素的解毒作用, 该酶在肝脏通过羟化等生物转化使这些药物和生物毒素等降解, 然后经肾脏排出[3]。因此CYP2D6 在药物毒理学和药代动力学等方面的研究受到广泛的重视。
药物代谢多态性可以引起病人间临床用药的疗效或毒性差异[4]。CYP2D6 基因位于22 号常染色体
上, 基因呈多态性, 约有70 多种等位基因突变体, 对药物的代谢呈现明显的个体差异和种族差异, 这是造成临床用药个体差异的主要原因。其中CYP2D6*10在中国人群中的发生率高达51.3%[3], 与CYP2D6*1比较, 氨基酸的相应变化是34 位Ser 变为Pro, 486位Thr 变为Ser。
CYPOR 是一个位于大多数细胞的核膜和内质网上的黄素蛋白, 它可以在还原型辅酶Ⅱ (NADPH)
与CYP450 之间传递电子。它是分子量约为78 kD的膜结合蛋白, 以黄素为辅基, 由一摩尔脱辅基蛋白
加上一摩尔黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavine-adenine dinucleotide, FAD) 和一摩尔黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide, FMN) 构成, 它的作用是在内部电子传递链中, 把电子从NADPH 传递到FAD 再到FMN,最后到细胞色素P450[5, 6]。
为了研究CYP2D6 及其突变体的活性差异, 本实验利用定点突变的方法将CYP2D6*10 变为CYP2D6*1, 在杆状病毒昆虫细胞表达系统中共表达了CYPOR 与CYP2D6*1/CYP2D6*10, 并用右美沙芬作为其底物测定了酶活性, 比较了CYP2D6*1 和CYP2D6*10 催化代谢右美沙芬的酶动力学差异。
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