二氧化钛富集磷酸肽方法优化及在腾_省略_厌氧菌磷酸化蛋白质组分析中的应用_林威

摘要：为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率，以６种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象，对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化。结果表明在乙腈含量为８０％（ｖ／ｖ），三氟乙酸含量为１％（ｖ／ｖ），二氧化钛用量与需要富集肽段的质量比为４０∶１的条件下，可以取得较好的富集效果。将优化后的富集方法应用于腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质的分析，初步鉴定到２５个磷酸化蛋白质，为进一步研究这种极端环境下生存的低等生物的生命活动提供了参考信息。

    蛋白质磷酸化是生物体内一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，磷酸化与去磷酸化是可逆的双向调节过程，生物体通过这一过程调控多种生命活动，不正常的磷酸化会使生命活动产生紊乱。在哺乳动物生命过程中，非常多的蛋白质会发生磷酸化修饰［１］。在真核生物中，蛋白质磷酸化修饰绝大部分发生在丝氨酸（占９０％）、苏氨酸（占９．９％）、酪氨酸（占０．１％）这３种氨基酸残基上［２］。研究一度认为细菌中磷酸化修饰只发生在组氨酸和天冬氨酸残基上，现在很多的证据表明细菌中同样存在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的磷酸化修饰［３］。
　　随着质谱技术的不断发展，磷酸化蛋白质的定性、定量研究进步迅速。但在磷酸化蛋白质的质谱分析过程中还存在许多问题，如：具有负电性的磷酸化肽段在质谱正离子模式分析时，信号会受到抑制。磷酸化肽段中的磷酰键比起肽键更容易断裂，使谱图解析难度增大。磷酸化肽段的化学计量值低［４］，在质谱检测时，大量的非磷酸化肽段会对磷酸化肽段的信号造成干扰和抑制。这些问题都给磷酸化肽段的鉴定造成了困难，因而在对较为复杂的样本进行分析时，磷酸化肽段的分离和富集过程就显得尤为重要。目前，固相金属离子亲和层析法（ＩＭＡＣ）［５，６］、强阳离子交换色谱法（ＳＣＸ）［７］、金属氧化物亲和色谱法［８，９］是几种常用的磷酸化肽段分离和富集的方法。金属氧化物亲和色谱法中的二氧化钛（ＴｉＯ２）法［８］因具有操作简单、富集效果好、成本低等优点，得到了广泛的应用。二氧化钛富集磷酸肽过程中会吸附一些特定的非磷酸肽，文献报道，在上样缓冲液中加入谷氨酸［１０］或者天冬氨酸［１１］可以有效地降低非特异性的吸附，提高磷酸肽的富集效率，而且不会造成离子源的污染。在二氧化钛富集磷酸肽的过程中，除了使用非特异性抑制剂外，其他富集条件的改变也会对富集效果产生影响。为了明确这些富集条件对富集效果的影响，筛选出最优富集条件，提高富集效率，本文以６种标准蛋白质混合物为研究对象，比较了二氧化钛富集过程中多种因素对磷酸肽富集效果的影响，优化出较好的富集条件，并将其应用于实际样品腾冲嗜热厌氧菌的磷酸化蛋白质研究。腾冲嗜热厌氧菌是在云南腾冲热泉中发现的厌氧、杆状、革兰氏阴性菌，生长环境在５０～８０℃［１２］。Ｂａｏ等［１３］通过基因组全测序发现：基因组共编码２　５８８个基因序列，根据同源比对，其中有１　７６４个蛋白质为功能已知蛋白质。目前文献中未见有关腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质的研究，开展这方面的研究有助于增加对这种生命起源早期生物的认识。