反相高效液相色谱法同时测定甘草酸单铵盐原料药主成分及有关物质含量

摘要：建立了同时测定甘草酸单铵盐原料药中主成分１８α－甘草酸、１８β－甘草酸及其有关物质Ａ、有关物质Ｂ含量的高效液相色谱法，并用于其质量标准的建立。采用Ｄｕｒａｓｈｅｌｌ　Ｃ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ），以１０ｍｍｏｌ／Ｌ高氯酸铵（氨水调节ｐＨ　８．２０）－甲醇（４８∶５２，ｖ／ｖ）为流动相，流速０．８０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长２５４ｎｍ，柱温５０℃，进样量１０μＬ。在优化的色谱条件下，１８α－甘草酸、１８β－甘草酸、有关物质Ａ、有关物质Ｂ在０．５０～１００ｍｇ／Ｌ范围内线性关系良好（ｒ＞０．９９９　９），检出限分别为０．１５、０．１０、０．１０、０．１５ｍｇ／Ｌ，平均回收率在９７．３２％～９９．３３％之间（ｎ＝３），相对标准偏差（ＲＳＤ）在０．０５％～１．０６％之间。本方法检测灵敏、重现性好，结果准确可靠，可用于甘草酸单铵盐原料药主成分及有关物质的检测分析，有利于其原料药的质量控制。

    甘草酸单铵盐１９９２年被国家卫生部定为治疗慢性肝炎的首选药物，其原料药主成分是１８α－甘草酸（１８α－ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ　ａｃｉｄ，１８α－Ｇｌｙ）和１８β－甘草酸（１８β－ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ　ａｃｉｄ，１８β－Ｇｌｙ），以及２个主要的有关物质，分别命名为有关物质Ａ 和有关物质Ｂ。１８α－Ｇｌｙ和１８β－Ｇｌｙ为一对差向异构体，其空间构型的微小变化使两者在理化性质、药效学、药代动力学及不良反应等方面存在着显著差异。目前关于甘草酸制剂检测方法的研究报道很多，如高效液相色谱－质谱联用法（ＬＣ－ＭＳ）［１，２］、毛细管区带电泳法［３，４］、高效液相色谱法［５－１０］、气相色谱法［１１］、薄层色谱法［１２］、极谱催化波法［１３］、紫外分光光度法［１４］等。高效液相色谱法具有准确、快捷、灵敏度高、重现性好和应用广泛等优点，是原料药和制剂质量标准研究
中常用的方法。原料药中１８α－Ｇｌｙ、１８β－Ｇｌｙ所占比例及有关物质含量是控制其制剂质量和安全的重要指标。在中国药典２０１０版中没有收载甘草酸单铵盐质量标准。在欧洲药典７．０版（ＥＰ７．０）和英国药典２０１２版（ＢＰ２０１２）收载的甘草酸单铵盐质量标准
中，将其主成分结构归属为１８β－Ｇｌｙ，将其中２个有关物质分别归属为有关物质Ａ（相对保留时间约为０．８）和１８α－Ｇｌｙ（相对保留时间约为１．２），并未提及有关物质Ｂ。经查阅相关文献［５］，ＥＰ７．０、ＢＰ２０１２和中国国家药品标准ＷＳ１－ＸＧ－２００２收载的甘草酸单铵盐质量标准中的流动相为酸性体系，对１８α－Ｇｌｙ、１８β－Ｇｌｙ异构体没有分离选择性，无法同时对其主成分１８α－Ｇｌｙ、１８β－Ｇｌｙ的含量及有关物质进行准确定量分析。由此，对主成分异构体的分离以及对色谱图中相对保留时间约为１．２的物质的结构归
属有待商榷。现有的甘草酸类制剂标准中尚未标注１８α－Ｇｌｙ、１８β－Ｇｌｙ所占比例，造成产品内在质量控制的缺失。目前对甘草酸类制剂中差向异构体的分析已有相关报道［１５，１６］，但有关甘草酸单铵盐原料药主成分及有关物质含量检测方法的研究尚未见文献报道。本实验在参考国内外相关文献和各国药典的基础上，建立了采用反相高效液相色谱（ＲＰ－ＨＰＬＣ）同时测定甘草酸单铵盐原料药主成分及有关物质含量的方法，可用于甘草酸单铵盐原料药主成分含量及有关物质的检测分析。