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关键词：
柱后衍生化,高效液相色谱,硫酸阿米卡星,荧光检测
发表时间：
2013-05-10 15:09:20
荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较
曲慧娜 | -> | 903| 1| 0.323474MB |荧光法,DNA杂交法,残余DNA,重组生物制品,质量控制
摘要目的: 对用于检测重组技术产品中残余DNA 的荧光法及DNA杂交法进行比较性评价。方法: 应用地高辛标记的DNA杂交法以及P icoG reen荧光法对3批重组人干扰素A2b中外源DNA 残留量进行测定。结果: 荧光法检测结果显示3批重组人干扰素A2b制品中DNA残留量分别为每人份剂量( 01 695 ? 01 021) ng、( 01 664 ? 01 021) ng、( 01916 ? 01017) ng, 而用地高辛标记的DNA杂交实验由于阳性基因组DNA灵敏度偏低以至于结果无法判断。应用琼脂糖凝胶电泳和P icoGreen荧光法测得由生产单位提供的阳性DNA浓度明显偏低, 与标示量不符, 这说明阳性DNA含量偏低是本次DNA杂交实验失败的主要原因。通过对该阳性DNA重新定量后再进行DNA 杂交检测, 结果显示3 批重组人干扰素A2b制品的DNA 残留量均小于每人份剂量1 ng , 该结果与P icoGreen荧光法相一致。结论: 荧光法具有简便、快速, 自动化程度高, 不受工程菌种类限制, 能够精确定量等特点, 优于传统的DNA 杂交法, 更适于重组制品残余外源DNA 含量的常规检定。
随着基因工程技术的迅猛发展, 越来越多的新药研制采用基因重组技术。由于在生产过程中使用了工程菌(细胞) , 而宿主菌(细胞)的残留DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质, 存在安全性问题, 因此宿主菌基因组DNA 残留量的检测极为重要。WHO和欧盟建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的残余DNA 含量为10 ng[ 1] ; FDA 要求其含量应不高于每人份剂量100 pg[ 2] ; 2005年版中国药典三部规定其含量应不高于每人份剂量10 ng[ 3 ] 。由于外源DNA 宿主种类繁多, 片段大小不一, 属微量杂质, 测定时干扰因素较多, 如何对其进行灵敏、快速、准确的检测是一项困难的工作。现行的检测方法主要是地高辛标记的DNA杂交法, 但这种方法需要生产单位提供宿主菌(细胞) DNA 标准进行杂交实验, 宿主菌DNA 的种属和质量直接影响到检测结果的可靠性。此外, DNA 杂交法实验操作周期长, 步骤烦琐, 干扰因素多, 重复性差, 不能进行定量分析[ 4] 。为了解决这些问题, 应用高灵敏度的双链DNA 荧光染料P icoGreen 对DNA 含量进行测定。该染料能够与双链DNA 结合形成复合物, 在波长480 nm 激发下产生超强荧光信号, 可用荧光酶标仪在波长520 nm 处进行检测, 在一定的DNA 浓度范围内以及该荧光染料过量的情况下, 荧光信号与DNA 浓度成正比[ 5, 6] 。荧光法可以不区分宿主菌来源, 能够检测出重组制品中全部DNA 污染。本文利用该荧光法对生产单位提供的阳性DNA 及重组生物制品中的残余外源DNA 进行分析, 从而进一步评价传统的地高辛标记的DNA 杂交法存在的问题。
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