pH敏感性的TAT肽修饰胶束的制备及其体外评价

摘要: 本文采用具有pH 敏感性的硬脂酰磺胺甲氧嘧啶、mPEG2000-DOPE 和TAT 肽 (transactivator of tranion peptide) 修饰的聚乙二醇化磷脂, 以薄膜分散法制备了载阿霉素的聚合物胶束。pH 敏感胶束在pH7.4 的粒径约为20 nm, 阿霉素的包封率为 (99.1 ± 2.1) %。流式细胞术显示, pH 7.4 和pH 6.8 时TAT 修饰的胶束均可迅速被摄取; 而pH 敏感胶束在pH 7.4 时进入细胞较少, pH 6.8 时进入细胞增多, 孵育1 h 后摄取量接近TAT修饰胶束。激光共聚焦显示pH 敏感胶束在pH 6.8 时肿瘤细胞摄取量显著大于pH 7.4。结果说明, 该胶束具有pH 敏感性, pH 7.4 时屏蔽TAT 肽, 避免其无选择性的透膜进入细胞, 而在pH 6.8 时暴露出TAT 肽, 发挥其进入细胞的能力, 介导载药胶束进入肿瘤细胞, 实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的。此pH 敏感胶束是一种有前景的肿瘤靶向给药系统。

    理想的给药系统应能特异性地聚集于治疗部位,并穿透靶向细胞将药物传递到细胞内。近年来, 促进细胞膜转运的多肽类物质 (cell-penetrating proteins,CPPs) 发展迅速, 代表性物质是TAT肽 (transactivatorof tranion peptide) 小分子。TAT 是一种具有很强的细胞膜穿透性的多肽, 它可以无选择性地穿透所有细胞的细胞膜进入细胞核[1]。Torchilin 等[2]研究发现TAT 修饰的载体在体外细胞实验中具有很强的靶向性, 但在体内TAT 肽可与血清蛋白结合, 不但缩短了载体在体内循环的时间, 而且降低了载体穿过肿瘤血管的量, 降低了肿瘤的治疗效果。
    文献[3]报道, 将人类癌细胞接种于小鼠体内, 用1H、19F 和31P 来测定肿瘤pH 值, 结果发现肿瘤pH平均值为6.84, 低于正常血液和组织液的pH 7.4, 推测主要原因在于肿瘤细胞吸收和代谢葡萄糖的速度较正常细胞快, 肿瘤细胞产生过量乳酸导致细胞内的pH 值降低。许多基于肿瘤组织的pH 特性的主动靶向给药系统研究取得一定成果[4]。Engin 等[5]利用pH 敏感的腙键, 构建了一种PEG 保护TAT 肽的纳米胶束, 但pH 5.0 远低于肿瘤组织的pH。Sethuraman等[6]发现聚合磺胺甲氧嘧啶能有效地将TAT 隐蔽在PEG-PLA 聚合物胶束内, 并在肿瘤的较低pH 时(6.6～7.0) 释放TAT 肽。Lee 等[7]发现TAT-聚组氨酸-聚乙二醇-聚乳酸材料制备的阿霉素胶束通过在正常pH 有效隐藏TAT, 在肿瘤组织释放TAT, 使胶束能够克服肿瘤的多药耐药, 降低药物的毒性。
    阿霉素是临床常用的化疗药物, 其分子易于降解, 并且由于选择性差而导致对正常组织的毒副作用大, 限制了其临床应用。针对此问题, 包载阿霉素的主动靶向脂质体[8]和胶束[9]等研究取得了一定的进展。Tang 等[10]发现聚乙二醇化磷脂包载阿霉素的胶束能够提高药物体内抗肿瘤效果, 降低药物的系统毒性。Lee 等[11]制备了TAT 修饰的阿霉素壳聚糖共轭物, 能提高药物的细胞毒性。但TAT 肽修饰在载体表面会一定程度导致载体进入正常组织, 降低其肿瘤靶向性。因此, 制备一种在正常组织和血液环境中能隐藏TAT 肽, 而在肿瘤组织中暴露TAT 肽的给药系统具有重要意义。
    为了降低TAT 修饰胶束在正常组织的穿透性,发挥TAT 肽对肿瘤细胞的高穿透性优势, 本文利用肿瘤pH 较低的特征, 以pH 敏感的硬脂酰磺胺甲氧嘧啶、PEG-DOPE 和TAT-PEG-DOPE 为材料, 构建一种在体内循环过程中隐藏细胞穿膜肽TAT, 穿过肿瘤血管进入肿瘤酸性微环境后, 自动弹出TAT, 介导载体实施主动转运的包载阿霉素的纳米给药系统(图1)。磺胺甲氧嘧啶在pH 7.0 以上时具有负电荷,会将带有正电的TAT 肽吸附在胶束的具有负电荷的内核表面, 将TAT 肽隐藏, 避免其无选择性地进入正常组织; 到达肿瘤组织时, 由于pH 低于7.0, 磺胺甲氧嘧啶呈正电荷, TAT 肽从胶束内核解离, 暴露在胶束表面, 介导载药胶束进入肿瘤细胞, 从而选择性杀伤肿瘤细胞。在构建胶束的基础上, 本文对pH 敏感胶束的特征进行表征, 并评价了其在不同pH 条件下进入肿瘤细胞的能力。