应用全细胞蛋白SDS_PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

摘 要 对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离，选择其中40株菌为接种菌株，通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力. 经过结瘤试验，发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外，其它38株菌株均与含羞草植物结瘤，结瘤率为95%. 从结瘤试验所获根瘤中，分离得到结瘤菌株，采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究. 蛋白图谱及聚类分析显示，26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同，在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起，说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致，因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株；而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异，推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株，尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力，这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证. 研究结果表明，全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法. 该方法进一步完善了结瘤试验，并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力，适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究. 图2 参28

    在根瘤菌资源研究和保藏中，研究者往往以结瘤试验来验证根瘤内分离菌是否为根瘤菌，却忽视了对结瘤试验所形成根瘤的菌株即结瘤菌株进行研究. 在根瘤菌的分离过程中，也分离到了土壤杆菌，并且土壤杆菌菌株也能与植物形成了根瘤，但经过对结瘤菌株的分离，发现结瘤菌株不是接
种的土壤杆菌，而是植物种子所带的根瘤菌菌株[1]. 因此，仅依靠结瘤试验来验证根瘤分离菌株是否为根瘤菌是片面的，不准确的.
    含羞草（Mimosa sp.）原产热带美洲，在我国分布于广东、海南、台湾、云南等地. 与含羞草植物共生结瘤的根瘤菌种类较其它豆科植物多样、复杂且特殊，到目前为止，已报道的能与含羞草植物结瘤的根瘤菌一共有7种，分别为菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）[2]、台湾贪铜菌（Cupriavidus taiwanensis）[原台湾诺尔斯通菌（Ralstonia taiwanensis）[3]]、加勒比伯克霍尔德菌（Burkholderia caribensis）[4]、瘤状伯克霍尔德菌（B. phymatum）[5]、含羞草伯克霍尔德菌（B.mimosarum）[6]、根瘤伯克霍尔德菌（B. nodosa）[7]和萨比亚伯克霍尔德菌（B. sabiae）[8]，其中除了菜豆根瘤菌R. etli属于α-变形杆菌纲外，其他6种较为特殊，隶属于β-变形杆菌纲，因此对含羞草根瘤分离菌的检测非常重要.
    对含羞草根瘤菌的验证已突破了传统的结瘤试验，有研究者采用菌株特异性引物对23S-5S rRNA基因间隔区（IVS）进行扩增和序列分析并以此作为分子标记准确地对含羞草结瘤菌株进行了检测验证[9]；也有研究者将绿色荧光蛋白基因（gfp）转入接种根瘤菌菌株中，直接观察到了根瘤菌对含羞根部侵染及根瘤形成的全过程[5, 10~12]. 但是这两种方法均存在操作烦琐、实验过程较长、不够快捷的缺点，仅适用于对少数菌株进行标记研究，对大量菌株进行检测尚存在不足.
    本研究采用全细胞蛋白SDS-PAGE指纹图谱方法对含羞草根瘤菌进行了结瘤能力的验证，旨在提供一种快速验证根瘤分离菌是否为根瘤菌的分子标记方法，比上述方法及16S-23SrRNA基因间隔区（IGS）分析[13~14]、RAPD [15]及AFLP [16]等标记方法更为简单、快速[17]，可以满足对大量菌株进行快速检测的要求.