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关键词：
葡萄酒,酒精发酵,生物调节剂
发表时间：
2012-12-28 09:15:03
摘要: 以中国科学院桃源农业生态试验站长期定位试验的土壤样品为对象, 采用PCR扩增、克隆测序等分子生物学技术, 研究长期施氮肥对水稻土亚硝酸还原酶基因nirK、nirS 多样性的影响. 序列分析结果表明, 从水稻土中克隆的系列nirK 基因片段与NCBI数据库中未知菌种的nirK 基因相似性较高, 平均达901 7%; 而n irS 基因片段与数据库中已知的n irS 基因相似度低, 平均7417%. 通过Chao1估计值预测, nirK 基因在不施肥处理( CK )、施氮肥处理( N )中分别有58 ? 13和49 ? 9个不同的OTUs, 而nirS 基因在CK 处理、N 处理中分别有49 ? 10和132 ? 43个不同的OTU s. Chao1预测曲线95%置信区间( 95% C Is)显示, 氮肥施用显著提高了nirS 基因的多样性, 而对nirK 基因多样性则无显著影响. LIBSHUFF分析比较N、CK处理克隆文库间的差异,结果显示nirK 基因处理间群落结构差异p < 01022, 达到显著水平; 而nirS 基因处理间的群落结构无显著差异. 系统发育分析显示, nirK、nirS 基因的系统发育树分别可分为3个及4个大簇. 施用氮肥导致nirK、nirS 克隆有不同程度的聚集, 说明氮肥改变了nirK 和n irS 基因群落结构, 其中氮肥对nirK 基因群落结构的影响更大. 总体来说, 氮肥的施用对水稻土nirK 基因群落多样性无显著影响, 但明显提高nirS 基因群落的多样性; 而长期施氮肥使含nirK 基因的反硝化菌群落结构发生显著变化, 对n irS基因群落结构则无显著影响.
氧化亚氮( N2O )作为仅次于CO2 和CH4 的管制温室气体, 产生的温室效应已经引起人们的广泛关注. 据估算, 75% 的N2O 来自于人类生产食物的过程, 其中有36% 来自于施用合成氮肥的农田[ 1 ] ,而一大部分是由土壤微生物主导的硝化、反硝化作用所产生的. 水稻田在非淹水条件下, 主要为硝化作用, 淹水条件下则以反硝化作用为主[ 2] .
反硝化过程是微生物在少量氧或微量氧存在的条件下, 以氮氧化物NO-3 作为电子受体, 将其还原为气态N2 的过程, 是土壤氮损失的一个重要机制,在氮循环中起着非常重要的作用[ 3, 4]. 土壤中能产生含氮气体化合物的微生物有3类: 异化反硝化细菌、非反硝化发酵性细菌和真菌、自养型硝化细菌.其中异化反硝化细菌是导致厌氧土壤氮素损失的主要作用者[ 5] .
反硝化过程主要由4种不同的酶主导: 硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶、氧化亚氮还原酶. 其中由亚硝酸还原酶诱导, 将亚硝酸还原成一氧化氮的反应, 是区分反硝化菌和硝酸盐呼吸菌的第一步, 后者不会将硝酸还原成气体[ 6] . 作为反硝化过程中的关键酶, 亚硝酸还原酶可以作为反硝化菌的分子标记[ 7] . 亚硝酸还原酶有2种不同的结构形态: 其中一种酶由含铜基( Cu-n ir) 的nirK 基因编码, 另一种由含有亚铁血红素c和d1 ( cd1-n ir)的nirS 基因编码. Coyne等[ 8] 对反硝化菌中亚铁血红素cd1 及含铜的亚硝酸还原酶的分布进行了研究,发现Alcaligenes eu trophus、Bacillu s azo toformans、Brady rhizobium japonicum、Corynebacterium nephridii、Rhizob ium spp. 这些细菌中含有含铜的亚硝酸还原酶, 而Aquasp irillum itersonii、F lavobacterium spp. 、P seudomonas f luorescens有含亚铁血红素的亚硝酸还原酶. nirS 编码的酶主要在P seudomonas菌株中占优势, 在不同菌株中分子量大小相似, 形态结构相对保守. 而nirK 基因在许多亲缘关系较远的菌株中存在, 且分子量变化较大. 这2种基因在特定的菌株中存在互斥的现象, 但在一些菌种的不同菌株中分别存在.
近年来, 已有不少关于nirK 及nirS 基因多样性的研究. Braker等[ 7] 发现普季特湾( Puget Sound)沉积物中nirS 基因的多样性高于华盛顿郊区(Wash ing tonm arg in)沉积物中nirK、nirS 基因的多样性. Sharma等[ 9 ] 发现nirK 基因可顺利从豆科植物的根系土壤中扩增, 且与数据库中已有nirK 基因序列不同, 但没有扩增到nirS 基因. 而Wo lsing等[ 10] 观察到施肥后耕地土壤中的nirK 基因反硝化菌群落结构受到季节变化的影响. 目前, 关于长期施肥对nir基因多样性影响的研究还不多, 因此本研究主要探讨长期施用氮肥对土壤nir基因多样性的影响.
以传统的微生物分离培养方法来研究土壤微生物种群结构, 会导致微生物多样性信息的严重丢失[ 11] . 随着分子生物学技术的发展, 使人们从分子水平更全面地认识土壤微生物多样性特征及变化成为可能. 利用微生物分子生态学方法从桃源长期施肥定位实验点土壤样品中扩增nirK 及n irS 基因片段, 通过分析nir基因多样性及系统发育关系, 研究长期单施氮肥对土壤反硝化群落的影响, 以期为研究水稻土长期施肥对N2O 排放的影响提供依据.
反硝化过程是微生物在少量氧或微量氧存在的条件下, 以氮氧化物NO-3 作为电子受体, 将其还原为气态N2 的过程, 是土壤氮损失的一个重要机制,在氮循环中起着非常重要的作用[ 3, 4]. 土壤中能产生含氮气体化合物的微生物有3类: 异化反硝化细菌、非反硝化发酵性细菌和真菌、自养型硝化细菌.其中异化反硝化细菌是导致厌氧土壤氮素损失的主要作用者[ 5] .
反硝化过程主要由4种不同的酶主导: 硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶、氧化亚氮还原酶. 其中由亚硝酸还原酶诱导, 将亚硝酸还原成一氧化氮的反应, 是区分反硝化菌和硝酸盐呼吸菌的第一步, 后者不会将硝酸还原成气体[ 6] . 作为反硝化过程中的关键酶, 亚硝酸还原酶可以作为反硝化菌的分子标记[ 7] . 亚硝酸还原酶有2种不同的结构形态: 其中一种酶由含铜基( Cu-n ir) 的nirK 基因编码, 另一种由含有亚铁血红素c和d1 ( cd1-n ir)的nirS 基因编码. Coyne等[ 8] 对反硝化菌中亚铁血红素cd1 及含铜的亚硝酸还原酶的分布进行了研究,发现Alcaligenes eu trophus、Bacillu s azo toformans、Brady rhizobium japonicum、Corynebacterium nephridii、Rhizob ium spp. 这些细菌中含有含铜的亚硝酸还原酶, 而Aquasp irillum itersonii、F lavobacterium spp. 、P seudomonas f luorescens有含亚铁血红素的亚硝酸还原酶. nirS 编码的酶主要在P seudomonas菌株中占优势, 在不同菌株中分子量大小相似, 形态结构相对保守. 而nirK 基因在许多亲缘关系较远的菌株中存在, 且分子量变化较大. 这2种基因在特定的菌株中存在互斥的现象, 但在一些菌种的不同菌株中分别存在.
近年来, 已有不少关于nirK 及nirS 基因多样性的研究. Braker等[ 7] 发现普季特湾( Puget Sound)沉积物中nirS 基因的多样性高于华盛顿郊区(Wash ing tonm arg in)沉积物中nirK、nirS 基因的多样性. Sharma等[ 9 ] 发现nirK 基因可顺利从豆科植物的根系土壤中扩增, 且与数据库中已有nirK 基因序列不同, 但没有扩增到nirS 基因. 而Wo lsing等[ 10] 观察到施肥后耕地土壤中的nirK 基因反硝化菌群落结构受到季节变化的影响. 目前, 关于长期施肥对nir基因多样性影响的研究还不多, 因此本研究主要探讨长期施用氮肥对土壤nir基因多样性的影响.
以传统的微生物分离培养方法来研究土壤微生物种群结构, 会导致微生物多样性信息的严重丢失[ 11] . 随着分子生物学技术的发展, 使人们从分子水平更全面地认识土壤微生物多样性特征及变化成为可能. 利用微生物分子生态学方法从桃源长期施肥定位实验点土壤样品中扩增nirK 及n irS 基因片段, 通过分析nir基因多样性及系统发育关系, 研究长期单施氮肥对土壤反硝化群落的影响, 以期为研究水稻土长期施肥对N2O 排放的影响提供依据.
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