力达霉素联合TRAIL对非小细胞肺癌的协同作用及其机制

摘要: 研究力达霉素 (LDM) 与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL) 联合作用对非小细胞肺癌细胞株H460细胞的增效作用及其作用机制。MTT法观察两药联合对H460细胞增殖的抑制作用。Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术和Hoechst 33342 荧光染色检测两药联合对细胞凋亡的影响。Western blotting 检测凋亡通路中PARP、Caspase-3 和Caspase-8 分子的变化以及LDM 对TRAIL 受体DR4、DR5 表达的影响。MTT 结果显示, LDM与TRAIL 的IC50 值分别为4.603×10−10 mol·L−1 和915.3 ng·mL−1, 在TRAIL (50 及100 ng·mL−1) 作用下LDM 的IC50 值分别为3.064×10−11 和1.611×10−11 mol·L−1。两药相互作用指数CDI<1。荧光显微镜下观察及流式细胞术检测两药联合细胞凋亡作用增强。联合用药组中Caspase-3 和Caspase-8 的激活作用明显增强。LDM能够增强TRAIL受体DR5 的表达, 不仅具有剂量依赖性, 且作用时间越长表达量越高。研究结果提示, LDM 对人非小细胞肺癌细胞株H460 细胞具有生长抑制作用, 可能通过诱导DR5 表达上调而促进TRAIL 诱导的肿瘤细胞凋亡, 抑制细胞增殖, 从而增加细胞对TRAIL 的敏感性。

    肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一, 其中80% 以上是非小细胞肺癌 (NSCLC); 其早期诊断率比较低, 对常用化疗药物存在固有或继发性耐药,并具有很高的转移率, 因此容易治疗失败[1]。临床上迫切需要高效低毒的治疗方法。力达霉素 (lidamycin,LDM) 是从我国湖北省潜江县土壤中分离的一株链霉菌 (Streptomyces globisporus C-1027) 代谢产物中筛选得到的一种新的大分子烯二炔类抗肿瘤抗生素,是迄今已报道的活性最强的大分子蛋白类抗肿瘤抗生素之一[2]。它由一个辅基蛋白和一个发色团构成,其分子质量为11 343 Da[3]。极低浓度LDM 即可快速抑制肿瘤细胞DNA 合成, 造成DNA 单、双链断裂,引起的双链断裂有序列特异性, 且形成的DNA 损伤不易被修复[4]。LDM 已经在中国进入了II 期临床研究[5]。
    TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand, 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)是由Wiley 等[6]于1995 年检索EST 时首次发现并克隆成功的, 为TNF 超家族成员之一, 是一种Ⅱ型糖蛋白。TRAIL 的胞外部分可降解形成可溶性sTRAIL,无跨膜区和胞浆区, 3 个sTRAIL 可形成钟形同源三聚体, 与相应受体结合后产生一定的生物学作用。3个sTRAIL 单体的230 位半胱氨酸共同构成TRAIL三聚体界面, 该界面中含有的一个锌离子和半胱氨酸残基是维持TRAIL 的结构和功能所必需的[7]。到目前为止, 已经发现了5 种TRAIL 受体, 分别是死亡受体 (DR4 和DR5)、诱骗受体 (DcR1 和DcR2) 和可溶性受体OPG[8]。死亡受体的表达与肿瘤进展相关,这种相关具有肿瘤组织特异性。在非小细胞肺癌中,低分化肿瘤的DR4、DR5、TRAIL 的表达是增加的[9]。但是, TRAIL 受体在肿瘤中的表达和分布还不十分明确, 仍然有很多问题亟待解决。TRAIL 能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡, 而正常组织细胞对其并不敏感,因此与TRAIL 相关的肿瘤治疗已经成为国内外研究的热点 [10]。目前TRAIL 与其他药物联合作用于肿瘤细胞的研究已经取得了一定的进展。
    已有多篇文献报道TRAIL与很多DNA损伤类化疗药物联合应用治疗肿瘤, 其中许多研究已经表明,损伤DNA 的化疗药物能够调节死亡受体的表达, 从而使细胞对死亡受体诱导的凋亡更为敏感。顺铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤、多柔比星、博来霉素、米托蒽醌等DNA 损伤类化疗药物主要通过p53 途径诱导人类肿瘤细胞的Fas 的表达, 从而促进人类肿瘤细胞对TRAIL 诱导的细胞凋亡的敏感性[11−13]。作为强效抗肿瘤抗生素, LDM 与TRAIL 联合作用于肿瘤细胞是否具有协同作用及其相关机制值得探究。本研究选用人非小细胞肺癌H460 细胞株, 观察LDM 在体外与TRAIL 的协同作用及其可能的增效机制。