作者曾经接触过不少刚从事GC工作的技术人员，他们能很快掌握必要的GC基础知识，甚至能很快操作仪器。但当接到一个分析任务时，面对样品不敢确定从何做起。也有一些人认为GC分析很简单，不就是打一针就可得到结果吗。其实不然！就如医院的护士打针，你若不了解病人情况，不知道用药的剂量，随便给病人打一针就能治病吗？这就涉及到了方法开发问题。简单地说，方法开发就是针对一个或一批样品建立一套完整的分析方法。就GC而言，就是首先确定样品预处理方法，然后优化分离条件，直至达到满意的分离结果。最后建立数据处理方法，包括定性鉴定和定量测定。当然，这一方法要真正成为实用方法，还必须进行验证。下面首先讨论方法开发的一般步骤。
（一）样品来源及其预处理方法
    GC能直接分析的样品必须是气体或液体，固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中，而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分（如无机盐）或可能会损坏色谱柱的组分。这样，我们在接到一个未知样品时，就必须了解它的来源，从而估计样品可能含有的组分，以及样品的沸点范围。如能确认样品可直接分析，问题就简单了。只要找一种合适的溶剂，如丙酮、己烷、氯仿、苯等就是GC常用的溶剂。一般讲，溶剂应具有较低的沸点，从而使其容易与样品分离。尽可能避免用水、二氯甲烷和甲醇作溶剂，因为它们对延长色谱柱的使用寿命不利。另外，如果用毛细管柱分析，应注意样品的浓度不要太高，以免造成柱超载，通常样品的浓度为mg/ml级或更低。
    如果样品中有不能用GC直接分析的组分，或者样品浓度太低，就必须进行必要的预处理，包括采用一些预分离手段，如各种萃取技术、浓缩方法、提纯方法等。下面给出一个简要的样品预处理指南（见表5-1-4），表5-1-4 样品处理指南(http://www.chemalink.net/books/C/776/0.html)有关各种处理方法的详细信息，请读者参看《色谱分析样品处理》分册。

    需要强调的一点是，无论样品处理方法，还是下面要讨论的GC分析条件确定，文献调研都是很重要的方法开发步骤。所以，开始实验前，应当查一下文献。若文献中已有相同样品的分析方法，那就会大大加快方法开发的过程。只要在此基础上作一些必要的优化即可。即使能找到类似样品的分析方法，也可以作为重要的参考，从而避免走一些不必要的弯路。
（二）确定仪器配置
    所谓仪器配置就是用于分析样品的方法采用什么进样装置、什么载气、什么色谱柱以及什么检测器。比如，要用GC分析啤酒的挥发性成分，就需要一个顶空进样器；要测定水中痕量含氯农药的残留量，就要用电子俘获检测器。就色谱柱而言，常用的固定相有非极性的OV-1（SE-30）、弱极性的SE-54、极性的OV-17和PEG-20M等。可根据极性相似相容原理来选用，即分离一般脂肪烃类（如柴油或汽油）时多用OV-1（SE-30），分析醇类和酯类（如含酒精饮料）多用PEG-20M，分析农药残留量则多用OV-17或OV-1701。而要分析特殊的样品，如手性异构体，就需要特殊的色谱柱。对于很复杂的混合物，SE-54往往是首选的固定相。
（三）确定初始操作条件
    当样品准备好，且仪器配置确定之后，就可开始进行尝试性分离。这时要确定初始分离条件，主要包括进样量、进样口温度、检测器温度、色谱柱温度和载气流速。
    进样量要根据样品浓度、色谱柱容量和检测器灵敏度来确定。样品浓度不超过12 3 14 时填充柱的进样量通常为1-5μL，而对于毛细管柱，若分流比为50:1时，进样量一般不超过2μL。如果这样的进样量不能满足检测灵敏度的要求，可考虑加大进样量，但以不超载为限。必要时先对样品进行预浓缩，还可考虑采用专门的进样技术，如大体积进样，还可采用灵敏度更高的检测器。
    进样口温度主要由样品的沸点范围决定，还要考虑色谱柱的使用温度。即首先要保证待测样品全部汽化，其次要保证汽化的样品组分能够全部流出色谱柱，而不会在柱中冷凝。原则上讲，进样口温度高一些有利，一般要接近样品中沸点最高的组分的沸点，但要低于易分解组分的分解温度，常用的条件是250-350℃。大多数先进GC仪器的进样口温度均可达到450℃。这时，沸点为+**7左右的组分均可汽化（因为在溶液状态下，组分的沸点会降低一些）。实际操作中，进样口温度可在一定范围内设定，只要保证样品完全汽化即可，而不必进行很精确的优化。注意，当样品中某些组分会在高温下分解时，就用适当降低汽化温度。必要时可采用冷柱上进样或程序升温汽化（PTV）进样技术。
    色谱柱温度的确定主要由样品的复杂程度和汽化温度决定。原则是既要保证待测物的完全分离，又要保证所有组分能流出色谱柱，且分析时间越短越好。组成简单的样品最好用恒温分析，这样分析周期会短一些。特别是用填充柱时，恒温分析时色谱图的基线要比程序升温时稳定得多。对于组成复杂的样品，常需要用程序升温分离，因为在恒温条件下，如果柱温较低，则低沸点组分分离得好，而高沸点组分的流出时间会太长，造成峰展宽，甚至滞留在色谱柱中造成柱污染；反之，当柱温太高时，低沸点组分又难以分离。图5-1-3给出了一个示意图。说明程序升温的必要性。实际上，毛细管柱的一个最大优点就是可在较宽的温度范围内操作这样既保证了待测组分的良好分离，又能实现尽可能短的分析时间。

    一般来讲，色谱柱的初始温度应接近样品中最轻组分的沸点，而最终温度则取决于最重组分的沸点。升温速率则要依样品的复杂程度而定。在没有资料可供参考的情况下，建议毛细管柱的尝试温度条件设置为：

    注意，这只是方法开发时的初始参考条件，具体工作中一定要根据样品的实际分离情况来优化设定。
    检测器的温度是指检测器加热块温度，而不是实际检测点，如火焰的温度。检测器温度的设置原则是保证流出色谱柱的组分不会冷凝，同时满足检测器灵敏度的要求。大部分检测器的灵敏度受温度影响不大，故检测器温度可参照色谱柱的最高温度设定，而不必精确优化。比如在使用OV-101或OV-1毛细管色谱柱时，火焰离子化检测器（FID）的温度可设定为300℃。
    载气流速的确定相对容易一些，开始可按照比最佳流速（氮气约为20cm/s，氦气约为25cm/s，氢气约为30cm/s）高10%来设定。然后再根据分离情况进行调节。原则是既保证待测物的完全分离，又要保证尽可能短的分析时间。用填充柱时，载气流速一般设为30ml/min。
    需要指出的是，当仪器没有配置电子气路控制（EPC）时，必须通过皂膜流量计或测定死时间的方法来测定载气流速，通过调节往前压的方式来改变载气流速。色谱柱越长，内径越小，柱温越高，需要柱前压越高。表5-1-5给出了常用毛细管色谱柱采用的柱前压参考数值范围。初始条件一般设置为表中给定范围的上限，然后根据实际分离情况再进行优化。

表5-1-5 毛细管GC常用的柱前压参考值(http://www.chemalink.net/books/C/777/0.html)

    此外，当所用检测器需要燃烧气和/或辅助气时，还要设定这些气体的流量。有关检测器的说明书通常会列出适合的气体流量值，可供参考。比如，用毛细管柱和FID时，检测器气体流量可设定为：

    上述初始条件设定后，便可进行样品的尝试性分析。一般先分离标准样品，然后分析实际样品。在此过程中，还要根据分离情况不断进行条件优化。
（四）分离条件优化
    分离优化是一个很大的题目，有专门的优化理论来研究，市场上还有计算机软件可用于优化。本书不准备就此展开详细讨论，只是在下一节从实用的角度简单介绍优化方法。在这里只强调操作条件柱温和载气流速的优化。
    事实上，当样品和仪器配置确定之后，一个色谱技术人员最经常的工作除了更换色谱柱外，就是改变色谱柱温和载气流速，以期达到最优化的分离。柱温对分离结果的影响要比载气的影响大。
    简单地说，分离条件的优化目的就是要在最短的分析时间内达到符合要求的分离结果。所以，当在初始条件下样品中难分离物质对的分离度R大于1.5时，可采用增大载气流速、提高柱温或升温速率的措施来缩短分析时间，反之亦然。比较难的问题是确定色谱图上的峰是否单一组分的峰。这可用标准样品对照，也可用GC/MS测定峰纯度。如果某一感兴趣的峰是两个以上组分的共流出峰，优化分离的任务就比较艰巨了。在改变柱温和载气流速也达不到基线分离的目的时，就应更换更长的色谱柱，甚至更换不同固定相的色谱柱，因为在GC中，色谱柱是分离成败的关键。
（五）定性鉴定
    所谓定性鉴定就是确定色谱峰的归属。对于简单的样品，可通过标准物质对照来定性。就是在相同的色谱条件下，分别注射标准样品和实际样品，根据保留值即可确定色谱图上哪个峰是要分析的组分。定性时必须注意，在同一色谱柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，对未知样品的定性仅仅用一个保留数据是不够的。双柱或多柱保留指数定性是GC中较为可靠的方法，因为不同的化合物在不同色谱柱上具有相同保留值的几率要小得多。对于复杂的样品，则要通过保留指数和/或GC/MS来定性。事实上，GC/MS是当今GC定性的首选方法，它可以给出相应色谱峰的分子结构信息，同时还能做定量分析。不过，我们应当了解，GC/MS并不总是可靠的，尤其是一些同分异构体，它们的质谱图往往非常相似，故计算机检索结果有时是不正确的。只有当GC保留指数和MS图的鉴定结果相吻合时，定性的可靠性才是有保障的。
（六）定量分析
    在这一步骤是要确定用什么定量方法来测定待测组分的含量。常用的色谱定量方法不外乎峰面积（峰高）百分比法、归一化法、内标法、外标法和标准加入法（又叫叠加法）。表5-1-6列出了这些方法的原理和特点。

    根据比尔定律, 吸光度与试样浓度成正比, 在不同的吸光度( Absorbance,Abs) 范围内测量, 可引起不同的误差。分析工作者应予高度重视。分析样品浓度太低或浓度太高, 吸光度值超越了合适的范围, 都不会得到满意的结果。应使被分析样品的吸光度范围控制在一个合理的范围内。
    试样浓度不能太低, 吸光度不能太小, 信号过小, 光度噪声的影响较大,使仪器的信噪比下降, 被测试的试样浓度下限增高和分析误差增大, 如测试黄曲霉素, 因仪器的噪声太大, 测试数据从0. 4Ab s 开始就超过1%的相对误差。
    当光度噪声大到一定程度、吸光度小到一定程度时, 吸光度就根本不与样品的浓度成正比。甚至会产生试样浓度变稀时, 吸光度值反而增大( 噪声所致) ,以致无法得到稳定的测量数据。在常规分析时, 对大多数试样浓度大多取10～100μg/ ml , 相当0. 3～0. 7Abs 左右为最佳。
    试样也不能太浓, 吸光度也不能太大, 如果试样的吸光度太大, 因为杂散光的原因, 使分析测试结果严重偏离比耳定律, 可能会使分析误差增大。甚至会产生试样浓度增大时, 吸光度值反而减小等反常现象。杂散光可能使分析测试结果的数据偏小, 也可能偏大; 若测试波长以外的杂散光被试样吸收则测量数据偏小, 若测试波长杂散光不被试样吸收则测量数据偏大。

    在试样量允许时, 试样应选择靠近最佳吸光度值( 0. 434Ab s ) 的浓度。从理论上讲, 吸光度值为最佳值0. 434Abs 时, 分析误差最小。如果被测试样太浓时, 应向靠近0. 434Ab s 的方向稀释。在不同的吸光度上测试, 相对误差和绝对误差都不同。按照目前国际上一般高档紫外可见分光光度计给出的ΔT = ±0. 3% T, 笔者测试的结果见表6-3。测试在不同浓度或不同吸光度的相对误差列于表6-4。

特点：

● 高载量及高分辨率

● 稳定的的批间重现性

● 高的蛋白回收率，且蛋白不易失活 

● 极低的非特异性吸附

● 专为疏水性蛋白及改性蛋白（如PEG化抗体）设计

● 适用于常规生物样品的分离与制备

    供计算机检索的常用商用标准质谱谱库有三个，即NIST库、Wiley库及PMW库。NIST库有74000多张标准谱图（1992年版）、130000多张标准谱图（1998年版）、170000多张标准谱图（2002年版）、190000多张标准谱图（2005年版）、约220000张标准谱图（2008年版，包括药物库）。据称，该谱库的每张谱图都先经正确性检验，然后由两个评估人员核准，所以NIST库有较高的可靠性。Wiley库有220000张谱图（1989年）、275000张谱图（第6版）、338000多张谱图（第7.0版）、399000多张谱图（第8.0版），重复的有3万-4万张。色与NIST库不同之处在于从各种公开发表的文献资料中收集，未经复核。PMW库有4370张谱图(1992年版)，包括1500个药物和毒物、800个农药和污染物、2000个代谢物。需要说明的是标准谱图基本上由静态磁质谱仪器获得，而动态质谱仪器调谐以及实验参数的设置等都直接影响到谱库检索的匹配率。一般来说，一个未知物在谱库检索中其匹配率至少要大于80%．且二者在全谱离子丰度上的差值应小于20%，这才认为是候选的结果。

 

    NOESY谱和ROESY谱都属于NOE类相关谱。这两种二维谱的原理和效果有一些差别，主要根据所研究的有机化合物选择，但是这两种二维谱的外形和解析方法是一样的。进一步的了解请参阅有关文献（宁永成，2000）。

   在测定常规核磁共振氢谱之后，如果化台物的结构中有两个氢原子，它们之间的空间距离比较近(小于5×lO^-10m)，照射其中一个氢原子的峰组时测定氢谱，与该氢原于相近的另外一个氢原子的峰组面积会变化，这就是NOE效应。做NOE差谱：把后面测得的氢谱减去原来的（常规）氢谱，面积有变化的地方就会出峰，这就可以发现NOE效应。上述的方法是用一维谱的方式测定NOE效应。如果一个化合物中有若干成对的氢原子空间距离相近，需要照射若干次，这样显然不方便。NOE类的二维谱则是通过一张NOE类的二维谱找到一个化合物内所有空间距离相近的氢原子对。

    NOESY谱或ROESY谱的外观与COSY谱相同，只是NOE类相关谱中的相关峰反映的是有NOE效应的氢原子对。当然由于具有³J耦合的两个氢原子的距离也不远，因此在NOE类相关谱中也常出现相关峰（作图时采取措施尽量去除，但是难以完全除掉）。所以，在分析NOE类相关谱时要特别注意不是3J耦台的相关峰。某个相关峰所对应的

两个氢原子跨越的化学键数目越多，从NOE效应的角度来看意义越大。

   NOE类相关谱对于解决立体化学的问题作用很大。下面举两个例子。

   化合物C3-7的结构如下：

               

   其NOESY谱和NOESY谱的局部放大谱分别如图3.19和图3.20所示

          

          

    通过NOESY谱的数据，确定如下NOE效应，因而也就可以确定侧链的方向：

                

      

      

    从NOESY谱可以看到如下NOE效应：

                  

    苯蒸气作为紫外可见分光光度计的分辨率检验标准物质, 早已被淘汰, 因为苯蒸气评定紫外可见分光光度计的分辨率只能给出相对值, 不像光谱带宽的表示方法, 能给出具体测试值, 且苯对人体的危害很大, 特别是对人体的肝脏影响很大。其吸收光谱见图10-3。

                                 参考文献
1 中华人民共和国国家计量检定规程( J JG 178 - 1996 、J JG 375 - 1996 )
2 黄君礼等, 紫外吸收光谱法及其应用, 北京: 中国科学技术出版社, 1992
3 洪吟霞等, 分光光度计( 光学仪器丛书) , 北京: 机械工业出版社, 1982
4 Shimadz u , Int rdu ction To Ul t r a viole t a nd Visibl e Spec t rophotome t r ic An aly sis , Pr int ed in Ja pon
3010-07003-15 AIK-E , 1998
5 陈国珍, 黄贤智等, 紫外- 可见光分光光度法( 上、下册) , 北京: 原子能出版社, 1983
6 NBS. Sta nda rd Mothod of Test for UV/ VIS/ NIR Spec t rophotome te r , ASTM , E275-83 , 1983
7 ASTM. 1982 Annu al Book of ASTM St and ard s ( Pa r t 42 ) ( P r iut ed in U. S. A. ) , 335 , 1982
8 JB. 紫外可见-近红外分光光度计( 中华人民共和国机械行业标准) , 5 , 1992
9 M. Wins tea d. In st rument Ch eck Syst ems ( Publish ed in Gr eet Br it ain , P r int ed in th e U. S. A. ) , 22～
24 , 1971

附录一 国内外主要高档紫外可见分光光度计一览

附录二 国内外主要中高档紫外可见分光光度计一览

附录三 国内外主要中低档紫外可见分光光度计一览

附录四 国内外主要普及型紫外可见分光光度计仪器一览

附录五 有关的其他重要资料

一、电磁波谱

                         附图1 各种色光的波长
   如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合, 也可成为白光, 这两种颜色的光称为互补色光。
   互补色对使用者( 尤其是对初学的使用者) 很有用; 在研究工作中, 当拿到一个未知试样后, 不知用什么波长测试为好, 特别在仪器不具有自动扫描功能时, 一时很难找到合适的测试波长, 这时, 可根据试样的颜色, 利用互补色的原理, 很快找到测试波长的区域, 而后, 可以较快找到合适的测试波长。

三、分析工作者经常使用的一些重要的物理常数见附表6

四、A-T 值换算表

 

五、溶液透射比与测定准确度的关系(见附表8)

    由附表9 可知, 紫外可见分光光度计测定结果的相对误差最小的最佳透射率为T = 37%左右( A = 0. 434) 。

六、一些溶剂的透明范围

 

七、几种重要的无机显色剂(见附表10)

 

    根据比尔定律, 吸光度与试样浓度成正比, 在不同的吸光度( Absorbance,Abs) 范围内测量, 可引起不同的误差。分析工作者应予高度重视。分析样品浓度太低或浓度太高, 吸光度值超越了合适的范围, 都不会得到满意的结果。应使被分析样品的吸光度范围控制在一个合理的范围内。
    试样浓度不能太低, 吸光度不能太小, 信号过小, 光度噪声的影响较大,使仪器的信噪比下降, 被测试的试样浓度下限增高和分析误差增大, 如测试黄曲霉素, 因仪器的噪声太大, 测试数据从0. 4Ab s 开始就超过1%的相对误差。
    当光度噪声大到一定程度、吸光度小到一定程度时, 吸光度就根本不与样品的浓度成正比。甚至会产生试样浓度变稀时, 吸光度值反而增大( 噪声所致) ,以致无法得到稳定的测量数据。在常规分析时, 对大多数试样浓度大多取10～100μg/ ml , 相当0. 3～0. 7Abs 左右为最佳。
    试样也不能太浓, 吸光度也不能太大, 如果试样的吸光度太大, 因为杂散光的原因, 使分析测试结果严重偏离比耳定律, 可能会使分析误差增大。甚至会产生试样浓度增大时, 吸光度值反而减小等反常现象。杂散光可能使分析测试结果的数据偏小, 也可能偏大; 若测试波长以外的杂散光被试样吸收则测量数据偏小, 若测试波长杂散光不被试样吸收则测量数据偏大。

    在试样量允许时, 试样应选择靠近最佳吸光度值( 0. 434Ab s ) 的浓度。从理论上讲, 吸光度值为最佳值0. 434Abs 时, 分析误差最小。如果被测试样太浓时, 应向靠近0. 434Ab s 的方向稀释。在不同的吸光度上测试, 相对误差和绝对误差都不同。按照目前国际上一般高档紫外可见分光光度计给出的ΔT = ±0. 3% T, 笔者测试的结果见表6-3。测试在不同浓度或不同吸光度的相对误差列于表6-4。