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关键词：
浓香型白酒,人工老窖,老化,复合菌
发表时间：
2013-01-21 17:24:28
中药致肾毒性成分马兜铃酸A单抗制备及酶联免疫分析方法的建立
归鸿 | -> | 1266| 1| 0.349686MB |马兜铃酸A,单克隆抗体,中药,酶联免疫分析法
摘 要 采用活化酯法, 将马兜铃酸A 分别与牛血清蛋白( BSA)和卵清蛋白( OVA )偶联, 得到免疫抗原马兜铃酸ABSA 和包被抗原马兜铃酸AOVA。利用马兜铃酸ABSA免疫Ba l b /c小鼠, 制得鼠单克隆抗体1A11,单抗效价为2 104; 单抗为IgG1类, 轻链为型; 与其结构类似物马兜铃酸B、C 和D的交叉反应率分别为2 8%, 3. 5%和31. 2%。基于抗马兜铃酸A 单克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析方法( icEL ISA )的IC50为1 9 g /L, 检测范围为0. 5~ 7. 5 g /L。icELISA添加回收率为86% ~ 97%, 相对标准偏差在5. 2% ~ 11. 1%之间。利用所建立的icELISA 测定了6个中药材和5个中成药中马兜铃酸A的含量, 并用高效液相色谱法( HPLC)进行了验证, 其中关木通、广防己、天仙藤、马兜铃和青木香中均检测出马兜铃酸A, 而川木通和5个中成药中未检测到马兜铃酸A。结果表明: 本方法可用于中药中马兜铃酸A的快速检测。
马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物, 包括马兜铃酸A、B、C 和D等[ 1 ] 。近年来, 马兜铃酸的肾毒性已引起广泛关注, 各国纷纷对含马兜铃酸的中药采取管制及限制措施[ 2~ 5] 。研究表明, 马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸A 或其代谢物马兜铃内酰胺所致[ 6, 7] 。因此, 在检测马兜铃酸时, 常选择马兜铃酸A 为指标性成分。马兜铃科药用植物在我国广泛使用。由于马兜铃科植物许多名称混淆, 为确保临床用药的安全有效, 对于疑含有马兜铃酸类物质的药用植物及制剂必须进行严格检测, 制订限量用药标准。目前, 检测马兜铃酸的方法主要有薄层色谱法[ 8 ] 、紫外分光光度法[ 9] 、高效液相色谱法[ 10 ] 及酶联免疫分析法[ 11] 等。薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低; 高效液相色谱法(HPLC)灵敏度较高、测定准确, 是目前测定马兜铃酸最常用的方法, 但仪器设备昂贵, 对实验人员专业技能要求高。酶联免疫分析法具有灵敏、准确、前处理简单、适合大通量筛选等优点, 在医学诊断、食品安全检测、环境污染物监测等领域已得到广泛应用[ 12, 13] 。Yu等[ 11] 利用EDC /NHS将马兜铃混合酸( A /B)与OVA 偶联, 制备了抗马兜铃酸兔多克隆抗体, 但该抗体的灵敏度较差; T ian等[ 14] 将马兜铃酸B与BSA偶联, 制备得到抗马兜铃酸B 的单克隆抗体, 该抗体具有较好的特异性, 但灵敏度较差。本研究制备了马兜铃酸A的单克隆抗体, 建立了马兜铃酸A 的酶免疫分析技术。
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