温度和溶菌酶敏感菌株的L-谷氨酸合成

摘 要 用温度敏感型菌株发酵生产L-谷氨酸不存在生物素亚适量问题, 因此该方法在国际上被广泛使用. 通常采用对出发菌株进行传统诱变的方法获得温度敏感型菌株. 以谷氨酸棒杆菌CICC 10226为出发菌株，先克隆其ltsA基因，然后通过基因敲除的方法构建了突变菌株Corynebacterium glutamicum WT ⊿L，该菌株同时具有温度敏感性和溶菌酶敏感性. 经透射式电子显微镜观察发现，于38 ℃培养的突变株细胞与在30 ℃培养的同一种细胞相比，细胞明显增大，而出发菌株无该现象. 发酵试验表明，在生物素过量的情况下，在发酵进入细胞产酸期后通过将发酵温度从原来的30 ℃提高到38 ℃，温度敏感突变株的产酸量增加近5倍. 如果在发酵培养基中添加适量的琥珀酸和乙酸，该菌株与不添加的在30 ℃培养的对照相比，产酸量增加近6.5倍. 对于野生型出发菌株而言，在生物素过量的情况下，无论是否采用变温发酵方法都几乎不产酸. 说明温度敏感突变株即使在生物素过量的情况下也能通过变温发酵诱导其合成并分泌产生L-谷氨酸. 图10 表1 参13

    在通常的培养条件下，谷氨酸棒杆菌并不能分泌产生L-谷氨酸. 在工业发酵生产过程中，一般采用生物素限量或添加表面活性剂的方法来诱导细胞分泌产生L-谷氨酸[1]. 如果生物素过量，就会出现只长菌体而不产酸或菌体生长良好而产酸低的情况，生物素限量法亦无法用于采用富含生物素的原料如甜菜糖蜜进行的发酵生产[2~3]. 而表面活性剂的主要缺点为：添加量多，灭菌困难，是潜在的污染源，且菌体对表面活性剂的添加量极其敏感[4]. 添加青霉素或四卡因也可以诱导L-谷氨酸的分泌，但产量较低，且不宜在发酵生产条件下使用[5~6].

    1978年，Momose等分离得到一株Brevibacte r iumlactofermentum的突变菌株，该菌株以富含生物素的甜菜糖蜜为培养基进行培养，当温度从30℃上升到40℃后菌体分泌产生L-谷氨酸，产量为20 g/L. 这一发现开启了采用温度敏感菌株在生物素过量情况下进行L-谷氨酸发酵的探索和研究[7]. 陈宁等（2001）以黄色短杆菌TJ1为出发菌株，经DES和UV多次诱变，定向选育出了具有寡霉素（μg/mL）及1 g/L谷氨酸氧肟酸盐抗性标记的温度敏感突变株TMGO106，然后将该菌株与天津短杆菌TG961进行细胞融合，获得温度敏感型生产菌株CN1021 [8]. Takashi Hirasawa等（2000）
将野生型棒杆菌C. glutamicum KY9611染色体DNA的EcoRI片段接入Escherichia Coli – Corynebacterium glutamicum 穿梭载体pC2，然后将其导入温度和溶菌酶敏感的棒杆菌C.glutamicum KY9714，通过基因互补克隆发现了新基因ltsA，该基因的敲除可导致细胞对溶菌酶的敏感性、细胞生长的温度敏感性以及在生物素不限量情况下L-谷氨酸的过量合成[9]. ltsA基因编码的蛋白质是一种氨基转移酶，将谷氨酰胺转化成某些未知的细胞表面组成成分. 到目前为止，分别来自谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）、结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）、大肠杆菌（E. coli）以及红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）等的ltsA基因同源序列已被先后克隆[10].
    本研究旨在以谷氨酸棒杆菌CICC10226 为出发菌株，通过PCR方法克隆其中的ltsA基因，并以此构建ltsA基因敲除质粒，最终实现构建CICC10226的温度和溶菌酶敏感突变株的目的.