HPLC_ECD法测定大鼠血浆中银杏叶黄酮成分及药代动力学研究

摘要 目的: 建立大鼠灌胃银杏叶提取物后血浆中黄酮类成分的灵敏分析方法, 并进行药代动力学研究。方法: 血浆样品经葡萄糖醛酸苷水解酶水解后, 采用高效液相色谱分离及电化学检测, 同时分析大鼠血浆样品中槲皮素、异鼠李素和山柰酚。色谱柱为Ag ilent Zorbax E clipse XDB- C8 ( 150 mm @ 4. 6 mm, 5 Lm ), 流动相为甲醇- 异丙醇- 磷酸盐缓冲液( 磷酸二氢钠-磷酸, pH = 2) ( 15︰ 15︰ 70), 流速0. 8 mL# m in- 1, 检测电压为200 mV, 柱温30 e 。结果: 槲皮素、异鼠李素和山柰酚与其他内源性和药源性成分达到良好分离; 最低检测浓度达到0. 5 ng# mL- 1; 平均提取回收率分别为88. 7%, 86. 2%, 87. 0%; 准确度在92. 7% ~ 105. 3%之间, 日内精密度RSD小于6. 6%, 日间精密度RSD小于14. 1%, 样品分析时间为20 m in。大鼠灌胃给予银杏叶提取物10 m g# kg- 1后, 酶水解血浆中槲皮素、异鼠李素和山柰酚的半衰期分别为( 3. 53 ? 1. 88) h, ( 6. 94 ?41 05) h, ( 3. 97 ? 2. 30) h; 3个黄酮类成分在大鼠血浆中都显示明显的二次达峰现象。结论: 建立的检测方法能灵敏、特异、准确, 可用于银杏叶提取物灌胃给药后黄酮类成分的药代动力学研究。

    自20 世纪60 年代银杏制剂EGb761 问世以来, 国内外市场已有为数众多的银杏叶提取物产品。银杏叶提取物在临床上主要用于高血压、冠心病等心血管系统以及脑梗死、痴呆等神经系统疾病的治疗。黄酮是银杏叶提取物中的主要有效部位, 化学研究表明黄酮类成分主要由槲皮素、异鼠李素和山柰酚的多种糖苷组成[ 1] , 具有扩张血管、抗氧化、促进脂肪脂解等多种药理作用[ 2~ 4] 。
    药代动力学研究作为药物化学和药理作用之间的桥梁, 有助于进一步揭示银杏黄酮类成分发挥药效的机制。有研究显示给予银杏叶提取物后在水解和未水解的血、尿中检测不到黄酮苷和苷元[ 5], 但也有文献报道尿液或血浆经过水解后检测到苷元[ 6, 7] , 不同的结论可能是由于分析方法的灵敏度所致, 同时也表明银杏叶黄酮类成分的生物利用度较低。对于银杏叶黄酮类成分的体内分析主要有HPLC- UV、GC- MS、LC - MS 和LC - MS /MS 等几种方法, 其中HPLC - UV 方法的灵敏度较低, 需要较大给药剂量, 造成实验剂量和临床剂量偏离较大的弊端[ 8] 。GC- MS方法的灵敏度达到最低定量限( LLOQ) 1. 5 ng~ 10 pg, 但是该方法需要衍生化, 操作烦琐[ 9] 。LC - MS 方法的灵敏度也不够理想,LLOQ 仅为5 ng[ 10 ] 。LC - MS /MS 是较灵敏的检测方式, 但是实验成本较高, 并且不同流动相组成对待测成分的离子化能力和基质效应的影响有很大差很大的主要原因。Zhao Y 等建立的LC- MS /MS检测方法, 对槲皮素、山柰酚和异鼠李素的检测限达到0. 137, 0. 137, 0. 4 ng# mL- 1 [ 11] , 但N ielsen SE 等报道的LC - MS /MS 方法LLOQ 只达到3. 4 ~ 17ng[ 12] 。由于黄酮类成分具有多个酚羟基而易被氧化, 本文尝试采用高效液相色谱- 电化学(HPLC -ECD )检测方式建立高灵敏度并且操作简单的银杏叶黄酮类成分的体内分析方法, 能够适用于低剂量灌胃后银杏黄酮在大鼠体内的药代动力学研究。