酵母工程菌制备紫穗槐_4_11_二烯的研究

魏海涛 | -> | 1418| 0| 0.880512MB |紫穗槐-4,11-二烯合酶,酵母工程菌,紫穗槐-4,11-二烯

摘要: 构建了两种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌, 其中附加体型工程菌W303-1B[pYeDP60/G/ADS]含有表达载体pYeDP60/G/ADS。整合体型工程菌W303-1B[rDNA:ADS]是将ADS 基因的表达盒序列通过同源重组的方式整合到酿酒酵母W303-1B 基因组中。GC-MS 检测发酵产物, 结果表明这两种工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯, 但附加体型工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于整合体型工程菌的产量。Southern 杂交检测表明, ADS 基因以单拷贝的形式整合到W303-1B 基因组中, 低于附加体型工程酵母中的ADS 基因拷贝数。这些结果表明, ADS 基因的拷贝数与酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量呈正相关。

    紫穗槐-4,11- 二烯合酶 (amorpha-4,11-diene synthase, ADS) 是抗疟药物青蒿素生物合成途径中的关键酶, 它能催化FPP (farnesyl pyrophosphate, 法尼基焦磷酸) 环化形成紫穗槐-4,11-二烯[1]。1999 年,荷兰的Bouwmeestera 等[2]首次从青蒿中分离纯化得到ADS。此后, ADS 编码基因被不同课题组从青蒿中克隆出来[3−6]。由于ADS 的重要作用, ADS 基因的克隆极大地推动了青蒿素代谢工程的发展。
    青蒿素代谢工程就是将青蒿素生物合成相关酶基因导入微生物, 在微生物中重构一条青蒿素生物合成途径, 利用微生物生长繁殖快的特点, 批量生产青蒿素前体, 进而半合成青蒿素。近年来, 由于青蒿素代谢工程取得了一系列重要成果, 人们相信这种方法有可能成为未来青蒿素生产的主要方法[7, 8]。
    酿酒酵母是一种单细胞真核生物, 拥有转录后修饰功能, 操作简单、培养方便、繁殖迅速, 并能大规模发酵, 是理想的真核蛋白表达系统之一。酿酒酵母遗传背景较清楚, 次生代谢产物较简单, 能简化代谢工程产物的纯化。就萜类化合物的代谢工程而言,酿酒酵母中存在一条萜类化合物 (麦角甾醇) 的合成途径, 含有萜类合成的共同前体IPP (isopentenyl diphosphate, 异戊烯焦磷酸) 和DMAPP (dimethylallypyrophosphate, 二甲丙烯焦磷酸), 因此, 酿酒酵母适合于作为萜类化合物, 包括青蒿素的代谢工程宿主菌。
    本研究构建了两种紫穗槐-4,11-二烯合酶基因酵母工程菌: 附加体型和整合体型酵母工程菌。GC-MS检测发现这两种酵母工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯, 而且产量和ADS 基因的拷贝数呈正相关。

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