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关键词：
甜茶苷,超高效液相色谱-质谱联用,甜茶叶
发表时间：
2012-02-16 16:28:02
光谱法对照研究肌红蛋白及其突变体Mb_D60K_与H_2O_2的相互作用
华军 | -> | 1263| 0| 0.848084MB |肌红蛋白,Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）,过氧化氢,光谱法,蛋白结构
摘 要 为了解肌红蛋白（Ｍｂ）表面６０位天冬氨酸（Ａｓｐ）突变为赖氨酸（Ｌｙｓ）后对蛋白结构稳定性的影响，本文通过紫外－可见吸收光谱、荧光光谱和停流荧光光谱对照研究了模拟生理条件下野生型肌红蛋白Ｍｂ（ＷＴ）及其突变体Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）与过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）的相互作用。结果表明：在Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）与Ｈ２Ｏ２发生相互作用过程中，铁卟啉部位的紫外和荧光发射光谱数据与Ｍｂ（ＷＴ）相比，性质与功能均表现出显著差异。虽然只有一个氨基酸的改变，但其结构和性质发生明显变化，说明６０位氨基酸在稳定蛋白结构中有重要的作用。同步荧光光谱和停流光谱的结果同样表明Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）的结构与功能受Ｈ２Ｏ２的影响较小，Ｍｂ（ＷＴ）受Ｈ２Ｏ２影响明显。综合分析表明，Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）在与Ｈ２Ｏ２相互作用过程中，蛋白结构稳定性提高。
特定位点氨基酸的改变对蛋白结构与功能有着重要的影响，为了能够更清楚的了解肌红蛋白（Ｍｂ）的活性位点和结构域的功能，基因工程和化学修饰手段被广泛用于该研究领域［１］。王静云等报道马心肌红蛋白突变体Ｍｂ（Ｄ４４Ｋ）增强了Ｍｂ的耐热、耐酸变性能力。Ｒａｆｆａｅｌｌａ Ｒｏｎｃｏｎｅ［２］等将Ｍｂ（Ｔ６７Ｒ／Ｓ９２Ｄ）与原血红素－Ｌ－组氨酸甲酯重建，得到稳定的衍生物Ｔ６７Ｒ／Ｓ９２Ｄ－Ｈ，经过配体结合实验发现，Ｔ６７Ｒ／
Ｓ９２Ｄ－Ｈ比Ｍｂ（ＷＴ）对叠氮化物和咪唑有更强的亲和力；当有酚类底物存在时，具有更强的拟过氧化氢酶活性。Ｌｌｏｙｄ等［３］将马心Ｍｂ血红素结合腔中处于亚铁血红素（ｈｅｍｅ）远端的Ｖａｌ６８用组氨酸进行了替换，得到的突变体蛋白Ｍｂ（Ｖ６８Ｈ）具有低自旋双组氨酸（ｂｉｓ－Ｈｉｓ）配位的血红素辅基（Ｈｉｓ６８／Ｈｉｓ９３），使得Ｍｂ（Ｖ６８Ｈ）具有了类似细胞色素ｂ５的光谱学与生物电化学的性质和功能，这是野生型Ｍｂ所不具
备的。长期以来人们认为蛋白表面的氨基酸残基暴露在溶剂中，对蛋白的稳定性影响甚微，但最近几年研究成果对这一观念提出了质疑，发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具有非常大的影响，从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用来调节蛋白结构稳定性及功能的新思路［４］。
Ｍｂ是由一条肽链组成的含血红素的储氧蛋白，由于Ｍｂ血红素辅基的存在，其可以催化Ｈ２Ｏ２分解为Ｈ２Ｏ 和Ｏ２。在没有底物存在的条件下与Ｈ２Ｏ２形成稳定的过氧化氢复合物（ＣｐｄⅡ）［５］。作为一种模型蛋白，Ｈ２Ｏ２对Ｍｂ结构与功能的影响以及其与Ｈ２Ｏ２
的作用机制一直是科研工作者的研究热点［６］。
本文中以野生型肌红蛋白基因为模板［７］，通过ＰＣＲ定点突变方法将肌红蛋白第６０位天冬氨酸Ａｓｐ（Ｄ）突变为赖氨酸Ｌｙｓ（Ｋ），经热激转化到大肠杆菌ＢＬ２１中，进行高效表达，得到表达产物经过分离纯化，获得突变体Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）用于其结构和功能的研究。
本实验室在研究中发现Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）在与表面活性剂相互作用的过程中其稳定性有很大程度的提高［８］，为进一步研究表面氨基酸在蛋白结构稳定性中发挥的作用，本文对照研究了Ｈ２Ｏ２对Ｍｂ（ＷＴ）和Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）结构稳定性及功能的影响。
Ｓ９２Ｄ－Ｈ比Ｍｂ（ＷＴ）对叠氮化物和咪唑有更强的亲和力；当有酚类底物存在时，具有更强的拟过氧化氢酶活性。Ｌｌｏｙｄ等［３］将马心Ｍｂ血红素结合腔中处于亚铁血红素（ｈｅｍｅ）远端的Ｖａｌ６８用组氨酸进行了替换，得到的突变体蛋白Ｍｂ（Ｖ６８Ｈ）具有低自旋双组氨酸（ｂｉｓ－Ｈｉｓ）配位的血红素辅基（Ｈｉｓ６８／Ｈｉｓ９３），使得Ｍｂ（Ｖ６８Ｈ）具有了类似细胞色素ｂ５的光谱学与生物电化学的性质和功能，这是野生型Ｍｂ所不具
备的。长期以来人们认为蛋白表面的氨基酸残基暴露在溶剂中，对蛋白的稳定性影响甚微，但最近几年研究成果对这一观念提出了质疑，发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具有非常大的影响，从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用来调节蛋白结构稳定性及功能的新思路［４］。
Ｍｂ是由一条肽链组成的含血红素的储氧蛋白，由于Ｍｂ血红素辅基的存在，其可以催化Ｈ２Ｏ２分解为Ｈ２Ｏ 和Ｏ２。在没有底物存在的条件下与Ｈ２Ｏ２形成稳定的过氧化氢复合物（ＣｐｄⅡ）［５］。作为一种模型蛋白，Ｈ２Ｏ２对Ｍｂ结构与功能的影响以及其与Ｈ２Ｏ２
的作用机制一直是科研工作者的研究热点［６］。
本文中以野生型肌红蛋白基因为模板［７］，通过ＰＣＲ定点突变方法将肌红蛋白第６０位天冬氨酸Ａｓｐ（Ｄ）突变为赖氨酸Ｌｙｓ（Ｋ），经热激转化到大肠杆菌ＢＬ２１中，进行高效表达，得到表达产物经过分离纯化，获得突变体Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）用于其结构和功能的研究。
本实验室在研究中发现Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）在与表面活性剂相互作用的过程中其稳定性有很大程度的提高［８］，为进一步研究表面氨基酸在蛋白结构稳定性中发挥的作用，本文对照研究了Ｈ２Ｏ２对Ｍｂ（ＷＴ）和Ｍｂ（Ｄ６０Ｋ）结构稳定性及功能的影响。
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