破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球的制备及载药机制研究

摘要: 制备破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球, 并对微球的载药机制进行考察。采用乳化交联法在双水相中制备了荷正电的甲基丙烯酸羟乙酯-葡聚糖微球, 并基于静电作用原理后载破伤风类毒素疫苗。微球的zeta 电位随甲基丙烯酸二甲氨基乙酯加入量的增加而增大, 激光共聚焦显微实验表明, 异硫氰酸荧光素牛血清可以渗透进入阳离子葡聚糖微球的内部, 而不能进入中性葡聚糖微球。采用后载法制备的破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球的包封率显著高于前载法。改变甲基丙烯酸羟乙酯-葡聚糖的取代度可以调控阳离子葡聚糖微球的体外释放行为。

     由世界卫生组织等5 个国际组织倡议的全球儿童疫苗计划 (The children’s vaccine initiative, CVI)主要宗旨是促进开发及引入、改进现有疫苗及新创制的疫苗, 以加强保护全球儿童免遭传染病的侵害。研究改进破伤风类毒素的释放系统是 CVI 的主要目标之一[1]。破伤风能否被控制和消除有赖于成功率高的接种, 但目前破伤风的基础免疫需要3 个月内连续3次注射疫苗, 接种次数多和接种周期长使辍种率高达70%, 免疫效果差。因此为了减少破伤风疫苗注射次数, 提高接种覆盖率, 降低辍种率, 有效地预防破伤风, 需提供具有长效作用的单剂破伤风类毒素控释疫苗制剂, 实现一次注射全程免疫。微球技术已广泛用于药物、多肽和蛋白疫苗的研究与开发。目前, 国内外较常应用的微球材料为多聚乳酸-聚乙醇酸共聚物, 分别采用这些载体复乳法制备了破伤风类毒素微球, 并具有较高的包封率, 通过控制丙交酯和乙交酯的分子量调节降解时间达到缓
释目的, 体内免疫的初步实验证明了单剂量免疫微球的可行性[2−4]。但聚乳酸及其共聚物制备的微球主要存在以下不足: ① 作为药物载体的聚乳酸及其共聚物是疏水性材料, 对亲水性的疫苗或药物亲和性不强, 导致包裹量和包封效率低; ② 制备中常采用复乳法所用有机溶剂易引起蛋白凝聚及沉淀, 使疫苗活性丧失; ③ 释药初期突释量较大, 可达30%～40%; ④ 聚乳酸及其共聚物在降解过程中产生酸性环境致蛋白或疫苗的天然构象发生变化, 抗原性降低。
    利用水凝胶作为药物载体系统具有载药量大、释药与降解可控、生物相容性好等特点, 是目前控释药领域的研究热点。近年来, 引入功能基的葡聚糖水凝胶被广泛作为蛋白疫苗类药物载体进行研究。本实验室合成了生物降解葡聚糖衍生物——甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖 (dextran-hydroxyethyl methacrylate,dex-HEMA)。近期研究资料显示, 由这种化合物聚合而来的水凝胶在生理条件下的降解是通过存在于交联处可变形的碳酸酯团水解产生的。而且这些水凝胶具有很好的生物相容性, 因为它的降解产物是葡聚糖 (血浆增容药) 以及2-聚羟乙基甲基丙烯酸 (一种广泛用于生化产品药用的聚合物)。dex-HEMA 凝胶的降解进程可以通过改变交联密度进行调整, 降解所需时间可从几天到几个月[5−7]。
    本研究选择dex-HEMA 作为微球材料, 通过引入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯制备阳离子葡聚糖微球,并采用后载法包封破伤风类毒素 (tetanus toxoid,TT)。研究载药机制及载药方法对包封率的影响, 考察体外释药行为, 为长效蛋白微球制剂提供新的研究思路和可行性依据。