蜂蜜中外源性_淀粉酶残留量的测定_费晓庆

摘要：采用液相色谱－同位素质谱联用法（ＬＣ－ＩＲＭＳ）建立了测定蜂蜜中外源性γ－淀粉酶残留量的方法。先采用凝胶色谱柱对蜂蜜样品进行预分离，将样品中所含的酶与糖分离开。根据γ－淀粉酶可将底物麦芽糖酶解为葡萄糖的原理，在５５℃、ｐＨ　４．５的０．０３ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中将γ－淀粉酶与麦芽糖反应４８ｈ后，采用ＬＣ分离麦芽糖和葡萄糖，以ＩＲＭＳ测定酶解产物葡萄糖的含量来确定γ－淀粉酶的残留量。本方法的线性范围为５～２００Ｕ／ｋｇ，定量限为５Ｕ／ｋｇ，回收率为８９．６％～１０８．２％，相对标准偏差为３．３％～４．９％。采用本方法对市售蜂蜜和大米糖浆共３８个样本进行了考察，γ－淀粉酶的检出率为７６．３％。为了进一步验证本方法的检测能力，测定了掺入１５％（质量分数）大米糖浆的蜂蜜样品，测得γ－淀粉酶的含量为１０．２Ｕ／ｋｇ。本方法能够有效地从酶学的角度鉴定蜂蜜中是否含有大米糖浆。

    天然纯正的蜂蜜具有较高的营养价值，它富含各种糖、氨基酸、维生素、多酚、类黄酮等多种活性物质。由于纯正蜂蜜经济价值较高，少数蜂蜜生产商为了牟取非法利益，在纯正蜂蜜中掺入成本便宜的各类糖浆，大米糖浆是最近用于蜂蜜掺假的主要原料。蜂蜜掺假对蜂产品市场造成了极大的负面影响，使得广大消费者经济利益受损。因此，开发有效、灵敏的蜂蜜掺假检测方法变得极为迫切。
　　目前，蜂蜜掺假的鉴定方法主要有理化参数检测（糖指纹图谱［１］、氨基酸指纹图谱［２］、５－羟甲基糠醛含量、脯氨酸含量）、红外光谱法［３］、薄层色谱法［４］、核磁共振法［５］和元素分析－同位素质谱联用法［６］等，这些检测手段存在着干扰多、耗时长、灵敏
度低、无法鉴定碳－３植物糖浆掺假等不足。费晓庆等［７］利用液相色谱（ＬＣ）／元素分析－同位素质谱联用法测得蜂蜜中各组分碳同位素值的差值，提出了蜂蜜掺假鉴定的新方法，能够有效鉴定碳－３植物糖浆的掺假。
　　大米糖浆是国内蜂蜜掺假使用较多的碳－３植物糖浆，根据大米糖浆的生产工艺，需要使用γ－淀粉酶对大米淀粉进行酶解［８］。γ－淀粉酶（又称糖化酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶）能水解淀粉中的α－１，４葡萄糖苷键，它与α－淀粉酶联合作用能较快地将淀粉转化成葡萄糖，再经过葡萄糖异构化酶进行异构化，得到的大米糖浆在糖的组成方面与蜂蜜相似，将其掺入蜂蜜中即可实现掺假。文献报道指出，纯正蜂蜜中含有少量的淀粉酶（α－淀粉酶和β－淀粉酶），它们能将淀粉和糖原水解成糊精和麦芽糖，而γ－淀粉酶不具有上述性质；同时到目前为止，尚未见纯正蜂蜜中含有γ－淀粉酶的文献报道［９，１０］，因此通过测定蜂蜜中γ－淀粉酶残留量，可以从酶学的角度来鉴定蜂蜜是否掺入大米糖浆。
　　γ－淀粉酶的测定主要有分光光度法［１１］、葡萄糖酶电极法［１２］、液相色谱法［１３］和滴定法［１４］等。这些方法主要用于研究淀粉生产糖浆工艺中的样本，目前尚无文献报道蜂蜜中γ－淀粉酶残留量的检测方法。本文首先采用凝胶色谱根据分子体积大小将蜂蜜中的糖与酶进行预分离，确保完全收集样品中的酶溶液后，以麦芽糖作为酶解反应底物，在５５℃和
ｐＨ　４．５的０．０３ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液条件下酶解反应４８ｈ。酶解反应所得各组分经ＬＣ分离后，在同位素质谱（ＩＲＭＳ）的氧化炉中依次被氧化成ＣＯ２，通过ＩＲＭＳ在线测定各组分产生的ＣＯ２的峰面积，即得到相应各组分的含量，然后利用葡萄糖含量与酶含量之间的对应关系来确定γ－淀粉酶的残留量。本法灵敏度较高，通过对纯正蜂蜜、市售蜂蜜、大米糖浆和掺入一定量大米糖浆的蜂蜜样本的考察，能够有效检测出蜂蜜中γ－淀粉酶的残留量，从而能够鉴定出蜂蜜中是否掺有大米糖浆。