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关键词：
果酒,鸭梨,酿造,酵母,工艺
发表时间：
2012-10-22 15:46:30
TTC在发酵木糖高产乙醇的休哈塔假丝酵母选育中的应用
张庆涵 | -> | 992| 1| 1.029798MB |微生物,TTC,乙醇,木糖,休哈塔假丝酵母,选育
摘要： TTC 可以作为筛选发酵葡萄糖产酒精能力强的酵母菌的显色剂，但发酵木糖产乙醇的酵母菌的代谢和发酵途径与之相比都有所不同，本实验用TTC 作为初筛显色剂筛选发酵木糖产酒精能力较强的休哈塔假丝酵母。紫外诱变后从TTC 平板上挑取显红色菌株150 株进行摇瓶发酵测定乙醇产量，得到的正突变率为29 %，负突变率为10 %；挑取显白色菌株100 株，得到的正突变率为0，负突变率为56 %。将紫外诱变后产量已经有所提高的突变株S28 进行氮离子注入诱变，从TTC 平板上挑取显红色菌株100 株进行摇瓶发酵测定乙醇产量，得到的正突变率为20.05 %，负突变率为10.14 %，其中的部分突变株的产量相比S28 又有所提高。可见TTC 能将乙醇产量较低的菌株淘汰，筛选出乙醇产量高的休哈塔假丝酵母菌。
红四氮唑， 全称2，3，5-氯化三苯基四氮唑， 简写TTC，它是一种显色指示剂，原是无色的，由于活菌中所含脱氢酶可将它还原成红色，可使平板上原先看不太清楚的微小菌落染成肉眼清晰可见的红色菌落[1]，且通过它呈色的深浅可判断酵母产酒精能力的高低,产酒精能力强的酵母会显现深红色，次之显粉红色、微红色或不显色[2]。
TTC 可以作为酿酒酵母利用葡萄糖产乙醇能力的显色剂，但是假丝酵母的木糖代谢产乙醇途径不同于酿酒酵母的葡萄糖代谢产乙醇途径。利用木糖的酵母的木糖代谢途径为：首先在依赖NADPH 的木糖还原酶作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖NAD+ 的木糖醇脱氢酶作用下氧化形成木酮糖，再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此进入磷酸戊糖途径(ppp)，ppp 途径的中间产物6-磷酸果糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，然后经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用生成乙醇。而酿酒酵母却是将葡萄糖经过EMP 途径生成丙酮酸，再经过丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用生成乙醇[3]。可见这两种代谢途径只是木糖和葡萄糖的酵解过程，也就是生成丙酮酸的过程不同，两种酵解过程中的脱氢酶可能不同，此后的丙酮酸生成乙醇的过程是相同的。而TTC 是与脱氢酶进行反应的，如果与TTC 反应是丙酮酸生成乙醇过程中的乙醇脱氢酶， 则显然TTC也可作为检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力显色剂。但如果与TTC 反应的是酵解过程中的脱氢酶，那么假丝酵母木糖酵解过程中的脱氢酶是否也能够如酿酒酵母葡萄糖糖酵解过程中脱氢酶一样使TTC 显色就有待考察， 所以TTC 作为显色剂对于检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力是否有效，需要通过实验确定。
此外，休哈塔假丝酵母对木糖发酵是“限制供氧”条件下进行的,所谓“限制供氧”条件,实际上就是既考虑到木糖的利用率,又考虑到酒精得率的一种平衡。少量的氧气对木糖等戊糖酵母发酵是必需的,因为木糖代谢成乙醇的过程中,木糖醇氧化成木酮糖和磷酸戊糖循环两步均需要氧作为质子氢的接受体。当氧气供应不足时,木糖醇脱氢酶的辅酶NADH 积累,抑制了木糖醇脱氢酶的活力,由此导致发酵液中木糖醇的积累。如果氧气供给过多,木糖醇脱氢酶的活力比较强，大部分木糖将转化成酵母细胞而使发酵酒精得率下降[4～5]。也就是说当氧气供给很足时，木糖醇脱氢酶的活力比较强，作为脱氢酶也可以使TTC 显红色， 但是大部分木糖转化为菌体而未生成酒精，此时产酒精能力不一定强。这也说明TTC 是否能够作为检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力的显色剂需要通过实验确定。
本实验将休哈塔假丝酵母CICC 1766 进行紫外诱变，将诱变后的菌种进行TTC 平板培养，从平板上挑取显红色菌株150 株和显白色菌株100 株，进行摇瓶发酵测定乙醇产量，将其与未经过诱变的菌种的摇瓶发酵的乙醇产量进行比较，计算正负突变率，以此来验证TTC是否可以作为筛选发酵木糖产乙醇能力强的休哈塔假丝酵母的显色剂。再将紫外诱变后的菌种进行氮离子注入诱变，将诱变后的菌种进行TTC 平板培养，从平板上挑取显红色菌株100 株，测定发酵后乙醇含量，将其与氮离子注入诱变前的菌种的乙醇产量进行比较，再次验证TTC 是否可以作为筛选发酵木糖产乙醇能力强的休哈塔假丝酵母的显色剂。
TTC 可以作为酿酒酵母利用葡萄糖产乙醇能力的显色剂，但是假丝酵母的木糖代谢产乙醇途径不同于酿酒酵母的葡萄糖代谢产乙醇途径。利用木糖的酵母的木糖代谢途径为：首先在依赖NADPH 的木糖还原酶作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖NAD+ 的木糖醇脱氢酶作用下氧化形成木酮糖，再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此进入磷酸戊糖途径(ppp)，ppp 途径的中间产物6-磷酸果糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，然后经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用生成乙醇。而酿酒酵母却是将葡萄糖经过EMP 途径生成丙酮酸，再经过丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用生成乙醇[3]。可见这两种代谢途径只是木糖和葡萄糖的酵解过程，也就是生成丙酮酸的过程不同，两种酵解过程中的脱氢酶可能不同，此后的丙酮酸生成乙醇的过程是相同的。而TTC 是与脱氢酶进行反应的，如果与TTC 反应是丙酮酸生成乙醇过程中的乙醇脱氢酶， 则显然TTC也可作为检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力显色剂。但如果与TTC 反应的是酵解过程中的脱氢酶，那么假丝酵母木糖酵解过程中的脱氢酶是否也能够如酿酒酵母葡萄糖糖酵解过程中脱氢酶一样使TTC 显色就有待考察， 所以TTC 作为显色剂对于检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力是否有效，需要通过实验确定。
此外，休哈塔假丝酵母对木糖发酵是“限制供氧”条件下进行的,所谓“限制供氧”条件,实际上就是既考虑到木糖的利用率,又考虑到酒精得率的一种平衡。少量的氧气对木糖等戊糖酵母发酵是必需的,因为木糖代谢成乙醇的过程中,木糖醇氧化成木酮糖和磷酸戊糖循环两步均需要氧作为质子氢的接受体。当氧气供应不足时,木糖醇脱氢酶的辅酶NADH 积累,抑制了木糖醇脱氢酶的活力,由此导致发酵液中木糖醇的积累。如果氧气供给过多,木糖醇脱氢酶的活力比较强，大部分木糖将转化成酵母细胞而使发酵酒精得率下降[4～5]。也就是说当氧气供给很足时，木糖醇脱氢酶的活力比较强，作为脱氢酶也可以使TTC 显红色， 但是大部分木糖转化为菌体而未生成酒精，此时产酒精能力不一定强。这也说明TTC 是否能够作为检验假丝酵母发酵木糖生产乙醇的能力的显色剂需要通过实验确定。
本实验将休哈塔假丝酵母CICC 1766 进行紫外诱变，将诱变后的菌种进行TTC 平板培养，从平板上挑取显红色菌株150 株和显白色菌株100 株，进行摇瓶发酵测定乙醇产量，将其与未经过诱变的菌种的摇瓶发酵的乙醇产量进行比较，计算正负突变率，以此来验证TTC是否可以作为筛选发酵木糖产乙醇能力强的休哈塔假丝酵母的显色剂。再将紫外诱变后的菌种进行氮离子注入诱变，将诱变后的菌种进行TTC 平板培养，从平板上挑取显红色菌株100 株，测定发酵后乙醇含量，将其与氮离子注入诱变前的菌种的乙醇产量进行比较，再次验证TTC 是否可以作为筛选发酵木糖产乙醇能力强的休哈塔假丝酵母的显色剂。
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