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关键词：
液相色谱-串联质谱,母离子排除列表,串联质谱数据采集
发表时间：
2011-06-29 16:56:17
黄金蝉若虫体蛋白水解液的荧光标记及电喷雾质谱鉴定
王维嘉 | -> | 2152| 0| 0.624574MB |高效液相色谱,离子阱/质谱,荧光检测,柱前衍生,2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑-乙氧基)-乙基]氯甲酸酯,氨基酸
摘要采用2[2(7H二苯并[a,g]咔唑乙氧基)乙基]氯甲酸酯(DBCECCl)作为柱前衍生试剂,于室温
下,在硼酸钠缓冲液(pH9.0)中,金蝉若虫体蛋白水解液中氨基酸的完全衍生化在5min即可完成。在
HypersilBDSC18色谱柱(200mm4.6mm,5m)上,采用梯度洗脱实现了各衍生物的完全基线分离。最佳荧光检测为ex/em=300/395nm。在线串联的ESI/MS正离子质谱数据显示:所有衍生物均给出m/z3385,294.5的特征碎片离子峰。荧光条件下的线性回归系数大于0.9992;检出限2.6~24fmol。本方法灵敏、可靠、重现性好。对实际黄金蝉若虫体蛋白水解液中氨基酸的测定,结果满意。关键词高效液相色谱离子阱/质谱;荧光检测;柱前衍生;2[2(7H二苯并[a,g]咔唑乙氧基)乙基]氯甲酸酯;氨基酸金蝉若虫又名黄金蝉、知了龟。蝉若虫有极高的药膳营养价值和独特的口感,尤以刚出土的若虫含蛋白质最高,是难得的高蛋白、低脂肪的野味佳肴。金蝉除了食用价值外,还有着极高的药用价值,具有强肝、瞑目、降压、镇痛、止血、改善糖尿病,提高消化能力的作用。氨基酸是构成生命有机体蛋白质的基本物质单元,也是生命代谢过程中不可缺少的营养物质。目前,测定氨基酸多采用离子交换色谱(IEC)、高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)等方法。这些方法多采用紫外[1]、荧光[2,3]、氢火焰离子化[4]和化学发光检测[5]。多数氨基酸仅表现出弱的紫外吸收,直接紫外检测难以获得满意的灵敏度,因此进行化学衍生是提高该类化合物检测灵敏度的有效途径。高效液相色谱荧光衍生化中,被广泛应用的衍生试剂主要有邻苯二甲醛(OPA)[6~8]、4氯7硝基苯并1,2,3二唑(NBDCl)[9]、1二甲氨基萘5磺酰氯(DansylCl)[10]、芴甲氧羰基氯(FMOCCl)[11,12]和6氨基喹啉基N琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC)[13,14]。这些衍生试剂在实际应用中都存在一定缺陷,如OPA重现性和衍生物的稳定性较差,衍生化受时间、温度和光照等因素的影响;NBDCl试剂在水溶液中的稳定性较差,见光易分解;FMOCCl衍生化需要经过萃取处理消除过量试剂的干扰,操作过程繁琐且易造成疏水衍生物的丢失;AQC在水相体系下量子化效率低,不利于梯度洗脱。因此研制高灵敏且廉价的标记材料用于蛋白质氨基酸的测定十分必要。多环含氮杂原子的化合物通常具有较强的光致发光特性[15],例如含咔唑母体环类的衍生物。本实验室已对该类化合物进行了较多研究[16~18],合成的2[2(7H二苯并[a,g]咔唑)乙基]氯甲酸酯(DBCECCl)的分子母核是个含氮杂原子并具有五环并联的高共轭体系,与四环并联的共轭体系BCEOC[19]和BCECCl[20]分子相比,具有更强的光致发光性质。DBCECCl用于游离脂肪胺的标记具有良好的效果[16]。本研究考察了DBCECCl分子对氨基酸的标记、色谱分离和在线的质谱鉴定等参数的优化。实验表明,试剂与氨基酸的衍生化反应简便、快速,衍生条件温和,衍生物具有良好的荧光特性。1100型离子阱液相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司),配备四元梯度泵、在线真空脱气机、荧光检测器和自动进样器;电喷雾离子源(ESISource,大连依利特公司);HypersilBDSC18色谱柱(200mm4.6mm,5m,大连依利特公司);F7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)。CARY300Bio型紫外
其它试剂均为分析纯,实验用水由MilliQ超纯水系统制备。2[2(7H二苯并[a,g]咔唑乙氧基)乙基]氯甲酸酯(DBCECCl)的合成见文献[16]。
下,在硼酸钠缓冲液(pH9.0)中,金蝉若虫体蛋白水解液中氨基酸的完全衍生化在5min即可完成。在
HypersilBDSC18色谱柱(200mm4.6mm,5m)上,采用梯度洗脱实现了各衍生物的完全基线分离。最佳荧光检测为ex/em=300/395nm。在线串联的ESI/MS正离子质谱数据显示:所有衍生物均给出m/z3385,294.5的特征碎片离子峰。荧光条件下的线性回归系数大于0.9992;检出限2.6~24fmol。本方法灵敏、可靠、重现性好。对实际黄金蝉若虫体蛋白水解液中氨基酸的测定,结果满意。关键词高效液相色谱离子阱/质谱;荧光检测;柱前衍生;2[2(7H二苯并[a,g]咔唑乙氧基)乙基]氯甲酸酯;氨基酸金蝉若虫又名黄金蝉、知了龟。蝉若虫有极高的药膳营养价值和独特的口感,尤以刚出土的若虫含蛋白质最高,是难得的高蛋白、低脂肪的野味佳肴。金蝉除了食用价值外,还有着极高的药用价值,具有强肝、瞑目、降压、镇痛、止血、改善糖尿病,提高消化能力的作用。氨基酸是构成生命有机体蛋白质的基本物质单元,也是生命代谢过程中不可缺少的营养物质。目前,测定氨基酸多采用离子交换色谱(IEC)、高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)等方法。这些方法多采用紫外[1]、荧光[2,3]、氢火焰离子化[4]和化学发光检测[5]。多数氨基酸仅表现出弱的紫外吸收,直接紫外检测难以获得满意的灵敏度,因此进行化学衍生是提高该类化合物检测灵敏度的有效途径。高效液相色谱荧光衍生化中,被广泛应用的衍生试剂主要有邻苯二甲醛(OPA)[6~8]、4氯7硝基苯并1,2,3二唑(NBDCl)[9]、1二甲氨基萘5磺酰氯(DansylCl)[10]、芴甲氧羰基氯(FMOCCl)[11,12]和6氨基喹啉基N琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC)[13,14]。这些衍生试剂在实际应用中都存在一定缺陷,如OPA重现性和衍生物的稳定性较差,衍生化受时间、温度和光照等因素的影响;NBDCl试剂在水溶液中的稳定性较差,见光易分解;FMOCCl衍生化需要经过萃取处理消除过量试剂的干扰,操作过程繁琐且易造成疏水衍生物的丢失;AQC在水相体系下量子化效率低,不利于梯度洗脱。因此研制高灵敏且廉价的标记材料用于蛋白质氨基酸的测定十分必要。多环含氮杂原子的化合物通常具有较强的光致发光特性[15],例如含咔唑母体环类的衍生物。本实验室已对该类化合物进行了较多研究[16~18],合成的2[2(7H二苯并[a,g]咔唑)乙基]氯甲酸酯(DBCECCl)的分子母核是个含氮杂原子并具有五环并联的高共轭体系,与四环并联的共轭体系BCEOC[19]和BCECCl[20]分子相比,具有更强的光致发光性质。DBCECCl用于游离脂肪胺的标记具有良好的效果[16]。本研究考察了DBCECCl分子对氨基酸的标记、色谱分离和在线的质谱鉴定等参数的优化。实验表明,试剂与氨基酸的衍生化反应简便、快速,衍生条件温和,衍生物具有良好的荧光特性。1100型离子阱液相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司),配备四元梯度泵、在线真空脱气机、荧光检测器和自动进样器;电喷雾离子源(ESISource,大连依利特公司);HypersilBDSC18色谱柱(200mm4.6mm,5m,大连依利特公司);F7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)。CARY300Bio型紫外
其它试剂均为分析纯,实验用水由MilliQ超纯水系统制备。2[2(7H二苯并[a,g]咔唑乙氧基)乙基]氯甲酸酯(DBCECCl)的合成见文献[16]。
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