原子转移自由基聚合修饰银丝固定化_省略_器的制备及在蛋白质组鉴定中的应用

摘要: 针对传统溶液酶解存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷，通过电子转移生成催化剂的原子转移自由基聚合法修饰银丝，并以其为载体制备了一种新型的固定化酶反应器。用质谱考察了银丝固定化酶反应器( SW-Trypsin) 的酶解效率、重复性和回收率。结果表明: 绒毛状聚合物修饰的SW-Trypsin 的酶解效率较高，酶解标准蛋白牛血清白蛋白( BSA) 20 min 后，肽段的氨基酸序列覆盖率可达93%，高于传统溶液酶解方法酶解16 h 所得79%的覆盖率。使用该固定化酶反应器于一个月内8 次酶解BSA 所得的氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间，平均覆盖率为94%，显示出良好的稳定性。另外，该固定化酶反应器酶解马心肌红蛋白( MYO) 的回收率为87. 67%。最后，用SW-Trypsin 酶解腾冲嗜热菌全蛋白20 min，所鉴定到的氨基酸序列覆盖率和蛋白数量与同样条件下溶液酶解16 h 的结果接近，且零漏切位点肽段的比例更高。加之容易分离的优点，SW-Trypsin 在蛋白质组学的应用中具有良好的前景。

    对生物系统中蛋白质组进行研究可为更好地理解复杂的生物机制提供有用信息［1］。而在蛋白质组学研究中最常用的是“bottom-up”研究策略，其主要有两种工作流程: 一种是先在蛋白质水平上分离，再酶解后采用肽质量指纹谱［2］或采用串联质谱分析［3］; 而另一种则是全蛋白在不经过任何分离的情况下直接酶解后产生多肽混合物，该混合物经过多维色谱分离后采用串联质谱进行分析，将其产生的串联质谱数据通过搜库软件对蛋白质进行鉴定，该方法又常被称为“鸟枪法”［4］。鉴于上述两种主要的工作流程中都需要将蛋白质酶解后对其酶解产物进行质谱( MS) 分析，Bruening 等［5］就曾在文章中表示蛋白质的鉴定及其翻译后修饰的研究中最常用的方法是将蛋白质酶解后对其酶解产物进行MS 分析，蛋白质的酶解在蛋白质组学的研究中发挥着关键作用。
    由于胰蛋白酶可以特异性地切断精氨酸或赖氨
酸羧基端且酶解形成的肽段的相对分子质量适合于
质谱的质量鉴定范围［6］，所以胰蛋白酶成为蛋白质
组学研究中最常使用的蛋白酶［7］。传统的酶解方
法是将胰蛋白酶溶解在溶液中使用; 为防止胰蛋白
酶自身酶解带来的干扰肽段［8］，通常只加入少量的
胰蛋白酶，因此需要较长的酶解时间［9］，这就成为
高通量蛋白质组学研究中的限速环节［10］。为了解
决溶液酶解过程中存在的问题，蛋白质组学研究中
引进并发展了固定化酶技术。固定化酶技术由于其
稳定性好、可重复使用、易于分离等优势受到了越来
越多的关注［11］。目前已有很多关于固定化酶反应
器的报道，其材料也多种多样，包括纳米金颗
粒［12 － 14］、包裹二氧化硅的磁性纳米颗粒［15， 16］、氧化
石墨烯［17］、芯片材料［18， 19］、棉纱［20］、介孔材
料［21， 22］、石英毛细管整体柱［23， 24］ 以及杂化整体
柱［25］等，但绝大部分的载体都会有其缺陷。我们在
冯娟娟等［26］的工作基础上，发展了一种制备简单、
容易分离的金属丝固定化酶反应器，采用原子转移
自由基聚合反应( ATRP) ［27］生成带有环氧基团的聚
合物链，并使用环氧基固定胰蛋白酶。传统的ATRP
反应中的催化剂对O2
及H2O 较为敏感，不利于
反应的控制; 在本研究中，采用了电子转移生成催化
剂的原子转移自由基聚合( AGET-ATRP) ［28］的方法
在银丝表面修饰上含有环氧基的聚合物长链，制备
了一种极易分离的固定化酶反应器，并将其初步应
用于腾冲嗜热菌蛋白质组的鉴定。