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关键词：
FACE.磷化氢.释放通量.浓度.水稻田
发表时间：
2012-08-13 20:15:06
摘要: 为了构建高效除磷的微生物, 将来源于大肠杆菌的聚磷激酶基因( ppk ) 插入广宿主载体pBBR1MCS- 2 多克隆位点区, 得到质粒pBBR1MCS- 2- ppk . 以该质粒为模板, 通过PCR 扩增出携带有载体启动子和终止子序列的ppk 基因, 插入自杀型质粒pUTmin-i Tn5 中得到重组质粒pUTmin-i Tn5- ppk . pUTmin-i Tn5- ppk 经三亲接合作用进入Pseudomonas putida KT2440, 同时min-i Tn5
通过转座作用将ppk 整合到宿主菌株的染色体DNA 中, 获得基因工程菌Pseudomonas putida KT2440- PPK, 用于表达ppk . RT-PCR结果显示, ppk 基因在KT2440- PPK 中得到较高量的表达, 而在原始菌株KT2440 中表达微弱. 人工模拟污水实验结果表明, 接种1 h 时KT2440-PPK 中聚磷含量达到最大, 为3105 mgPg, 约是对照菌株KT2440 的15 倍. 测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440- PPK 可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.
通过转座作用将ppk 整合到宿主菌株的染色体DNA 中, 获得基因工程菌Pseudomonas putida KT2440- PPK, 用于表达ppk . RT-PCR结果显示, ppk 基因在KT2440- PPK 中得到较高量的表达, 而在原始菌株KT2440 中表达微弱. 人工模拟污水实验结果表明, 接种1 h 时KT2440-PPK 中聚磷含量达到最大, 为3105 mgPg, 约是对照菌株KT2440 的15 倍. 测定模拟污水中磷酸盐的含量表明,KT2440- PPK 可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐.
微生物包括Escherichia coli、Pseudomonas spp.等均具有积累无机磷酸盐, 生成多聚磷酸盐( polyphosphate), 即聚磷的能力. 但是, 天然条件下, 微生物聚磷能力通常较弱, 或者需要厌氧好氧交替环境才能有效聚磷[ 1~ 3] .
多聚磷酸盐即聚磷是由3~ 1 000 多个不等的正磷酸盐通过高能磷酸键连接而成的线性多聚
体[ 4~ 6] . 聚磷由聚磷激酶( poly-phosphate kinase, PPK)催化形成. 有学者通过转基因手段, 将聚磷酸激酶基因ppk 转化到各种质粒中[ 7, 8] , 过量表达聚磷激酶.携带重组有ppk 基因质粒的微生物或植物能够过量的吸收环境中磷酸盐形成大量聚磷. 从而用于废水中磷的去除[ 7~ 9] 或者利用聚磷的络合能力去除环境中重金属[ 10~ 15] . 通过重组质粒表达ppk 基因, 虽然能够过量地表达聚磷激酶, 但是, 质粒表达的缺点同样明显, 即不能稳定遗传, 重组质粒容易丢失. 只有在抗生素胁迫下才能够相对稳定存在, 由此引发实际应用成本的增加. 并且高拷贝质粒对菌的生命活动造成负担. 因而质粒作为载体表达ppk 基因有很大的局限. 另外, 当前用于废水中去除磷的研究中所用表达宿主全部为E . coli . E . coli 直接用于废水或自然水体磷的去除是不切实际的.
为提高ppk 基因遗传稳定性, 本项研究构建质粒pBR1MCS-2-ppk , 将ppk 基因构建在该质粒强启
动子下游. 进一步将含有启动子和终止子序列的ppk 基因插入到自杀质粒pUTmin-i Tn5 中, 经三亲接
合与转座作用整合到Pseudomonas putida KT2440 的DNA 上, 得到基因工程菌KT2440-PPK. 整合表达一定程度上解决了质粒表达的遗传不稳定的问题. 同时选择环境中以及废水处理的活性污泥中的优势种Pseudomonas putida 作为宿主. 可以用于实际的废水处理. 实验中人工配制生活废水, 考察所得基因工程菌KT2440-PPK 去除废水中磷的能力. 本研究目的是构建1 株能够稳定遗传的、具有一定实际应用能力的高效除磷基因工程菌, 并研究该工程菌在实际除磷中应用.
多聚磷酸盐即聚磷是由3~ 1 000 多个不等的正磷酸盐通过高能磷酸键连接而成的线性多聚
体[ 4~ 6] . 聚磷由聚磷激酶( poly-phosphate kinase, PPK)催化形成. 有学者通过转基因手段, 将聚磷酸激酶基因ppk 转化到各种质粒中[ 7, 8] , 过量表达聚磷激酶.携带重组有ppk 基因质粒的微生物或植物能够过量的吸收环境中磷酸盐形成大量聚磷. 从而用于废水中磷的去除[ 7~ 9] 或者利用聚磷的络合能力去除环境中重金属[ 10~ 15] . 通过重组质粒表达ppk 基因, 虽然能够过量地表达聚磷激酶, 但是, 质粒表达的缺点同样明显, 即不能稳定遗传, 重组质粒容易丢失. 只有在抗生素胁迫下才能够相对稳定存在, 由此引发实际应用成本的增加. 并且高拷贝质粒对菌的生命活动造成负担. 因而质粒作为载体表达ppk 基因有很大的局限. 另外, 当前用于废水中去除磷的研究中所用表达宿主全部为E . coli . E . coli 直接用于废水或自然水体磷的去除是不切实际的.
为提高ppk 基因遗传稳定性, 本项研究构建质粒pBR1MCS-2-ppk , 将ppk 基因构建在该质粒强启
动子下游. 进一步将含有启动子和终止子序列的ppk 基因插入到自杀质粒pUTmin-i Tn5 中, 经三亲接
合与转座作用整合到Pseudomonas putida KT2440 的DNA 上, 得到基因工程菌KT2440-PPK. 整合表达一定程度上解决了质粒表达的遗传不稳定的问题. 同时选择环境中以及废水处理的活性污泥中的优势种Pseudomonas putida 作为宿主. 可以用于实际的废水处理. 实验中人工配制生活废水, 考察所得基因工程菌KT2440-PPK 去除废水中磷的能力. 本研究目的是构建1 株能够稳定遗传的、具有一定实际应用能力的高效除磷基因工程菌, 并研究该工程菌在实际除磷中应用.
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