体积排阻色谱法测定低分子量肝素抗凝血因子Xa的活性

摘要: 发展了一种基于体积排阻色谱测定低分子量肝素( LMWH) 抗凝血活性的方法。利用肝素与抗凝血酶Ⅲ( ATⅢ) 结合后可增强ATⅢ对凝血因子Xa( FXa) 抑制作用的原理，通过测定加入LMWH 后FXa 水解其生色底物产生对硝基苯胺( pNA) 这一反应的抑制程度确定LMWH 的活性。首先将含有一定浓度LMWH 的缓冲溶液与ATⅢ溶液混合，然后依次加入FXa 和生色底物，分别孵育一段时间。底物被FXa 水解，产生游离的pNA。体积排阻色谱可将小分子产物pNA 与其他大分子分离开，因而可以在pNA 的最大吸收波长下得到高灵敏度的测定，并且不再受其他成分的干扰。该方法重复性好，灵敏度高，极大地减少了样品的消耗量，降低了成本，并且还可进行各种复杂样品( 如血浆) 中LMWH 抗FXa 活性的监测。

    低分子量肝素( LMWHs) 是一类抗凝血药物，广泛用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗［1］。其抗凝作用是通过与血液中的抗凝血酶Ⅲ( ATⅢ) 发生相互作用完成的。高负电荷密度的肝素能与ATⅢ上带正电的赖氨酸结合，使ATⅢ的分子结构发生变化，暴露出活性部位的精氨酸，从而大大增加了ATⅢ与凝血因子中丝氨酸接触的概率，可使其抗凝血活性增强1 000 倍左右［2］。与普通肝素相比，LMWHs增强了对凝血因子Xa( FXa) 活性的抑制，但降低了对凝血酶活性的抑制，同时减少了它与内皮细胞、巨噬细胞及其他非特异性血浆蛋白的结合，因而具有出血副作用小、生物利用率高、皮下注射吸收好、半衰期长等优点［1，2］。
    经典的肝素活性的检测方法是凝血实验，如活化部分凝血活酶时间( activated partial thromboplastin time，APTT) 和活化凝血时间( activated clotting time，ACT) ［3 － 5］。这些方法易受实验室、试剂、仪器设备等条件变化的影响，并且灵敏度低，通常只能得到半定量的结果［3］。由于LMWHs 能够非常显著地抑制FXa 的活性，因此，测定LMWHs 对FXa 活性的抑制作用被认为是检测LMWHs 活性的黄金标准［6］。目前，最广泛使用的测定肝素抗FXa 活性的方法是底物生色法［7］。其测试原理为: LMWH 与过量的ATⅢ、FXa 混合，形成三元复合物LWMH·AT
Ⅲ·FXa; 形成复合物的FXa 不再具有凝血活性，而剩余的未形成复合物的FXa 仍能够水解其标记有发色团( 常用发色团为对硝基苯胺，pNA) 的肽底物，释放出可以被光度计定量测定的对硝基苯胺［8］。
    在405 nm 波长下检测到的吸光度值与样品中LWMH 的活性成反比，这样就可以间接获得LMWHs
的活性。尽管测定抗FXa 活性的分光光度测试比传统的凝血测试具有更高的检测灵敏度和准确度，但仍然存在一些缺点: 分光光度法要求样品足够清澈透明，而ATⅢ和FXa 都有紫外吸收，复杂样品
如血浆还有一定的浊度，因而在测定LMWHs 活性时会引起一定的误差; 此外，分光光度法所需要的样品量较大，尤其是ATⅢ和FXa，这些试剂价格昂贵，使得测试成本较高［9］。最近Harris 等［9 － 11］发展了基于荧光分析的抗FXa 测试方法，虽然可以避开样品背景吸收的干扰，但荧光底物的背景荧光对检测仍有较明显的干扰。
    体积排阻色谱( SEC) 采用化学惰性的多孔物质为固定相，按样品中各个组分相对分子质量大小实现分离。另外，熵驱动的SEC 分离机制，最大限度地降低了分析物与固定相间的直接作用，大大简化了分离条件，仅使用温和的流动相和简单的洗脱条件就可以实现分离［12］。目前SEC 已被广泛应用于大分子甚至是血浆蛋白的分离［12］。采用SEC 色谱分离的方法排除复杂样品基质的干扰，就可以实现更准确的测量。
    依诺肝素是当前使用最广泛的一种LMWH。用本文发展的基于体积排阻色谱的方法对依诺肝素
抗FXa 的活性进行了测试。方法以液相色谱自动进样器作为微量的酶反应器，依诺肝素、ATⅢ、FXa和生色底物的溶液依次进样，在进样器中混合、孵育，反应一段时间后，注入体积排阻色谱中进行分离检测。自动进样器大大减少了样品的消耗量。将酶反应产生的pNA 与样品中的其他物质分离后在其最大吸收波长( 385 nm) 下测定，提高了测试的灵敏度。通过方法的验证，证明了该方法具有较好的准确性和精密度。这种基于体积排阻色谱-液相色谱的方法还可以用于血浆中依诺肝素抗FXa 活性的监测。