vWF促进intein剪接的BDD_FV_的分泌和活性

摘要: vWF 是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白, 其主要功能之一为凝血VIII 因子 (FVIII) 的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein 可应用于双载体转移B 结构域缺失型FVIII (BDD-FVIII) 基因, 通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII 蛋白。为了研究vWF 对于intein 连接的BDD-FVIII 分泌和活性的影响, 通过intein 融合的BDD-FVIII 重、轻链基因和vWF 基因共转染培养的293 细胞,采用ELISA 观察了分泌至培养上清液中的由intein 剪接的全长BDD-FVIII 抗原量, 并用Coatest 检测了由其产生的活性。结果显示, vWF 基因共转染细胞上清液中, 全长BDD-FVIII 抗原量为 (235 ± 21) ng·mL−1, 活性为(1.98 ± 0.2) u·mL−1, 明显高于未转染vWF 的细胞[(110 ± 18) ng·mL−1 和 (1.10 ± 0.15) u·mL−1], 也明显高于单独转染BDD-FVIII 基因的对照细胞[(131 ± 25) ng·mL−1 和 (1.22 ± 0.18) u·mL−1], 表明vWF 基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII 基因后intein 剪接的BDD-FVIII 蛋白的分泌和生物活性。为基于蛋白质剪接的断裂BDD-FVIII基因转移的甲型血友病基因治疗研究中, 应用vWF 基因共转移以提高治疗的功效提供了依据。

    甲型血友病基因治疗中运用AAV 载体的凝血VIII 因子 (FVIII) 基因转移受AAV 载体的容量限制,在已有的解决AAV 载体容量限制的策略中, intein 的蛋白质反式剪接技术可作为一个行之有效的备选方案。Intein 是包埋在蛋白质前体中的小肽序列, 翻译后通过其自催化作用在蛋白质水平将其自身切除并伴随两侧宿主蛋白以肽键相连, 此作用类似于RNA剪接被称为蛋白质剪接作用。迄今发现的100 多种intein 主要存在于原核生物和单细胞真核生物, 主要为发生于同一分子内的顺式剪接, 但也发现有天然存在的发生于分子间的反式剪接intein 如Ssp DnaEintein[1], 而且人工断裂的顺式剪接的intein 也可进行反式剪接[2]。Intein 的高效、精确和非细胞机制依赖性的蛋白质剪接作用特点使其成为蛋白质工程和药物开发如体内外多肽的连接、多肽环化、蛋白质纯化、生物传感器及基因治疗等的有力工具[3, 4]。最近作者运用Ssp DnaB intein 的蛋白质反式剪接进行的双载体真核细胞转BDD-FVIII (B 结构域大部分缺失的功能性FVIII, B-domain deleted FVIII) 基因研究表明[5], 通过翻译后的蛋白质剪接作用可有效连接BDD-FVIII 蛋白并产生凝血生物活性。作者还用体外培养细胞进行的intein 对氯离子通道蛋白CFTR 的剪接实验表明, 剪接产生的CFTR 蛋白具有与野生型CFTR 一致的氯离子通道功能[6]。由于双载体共转染同一细胞的不均衡性、表达水平存在的差异、蛋白分子间相互作用的不完全性以及非天然宿主蛋白对所选用的intein 剪接反应的影响, 仍然能观察到未被剪接的前体蛋白。vWF 作为主要由巨核细胞和内皮细胞合成和分泌的一种血浆多聚体超分子蛋白, 其主要功能之一为与血浆中的FVIII 结合, 具有FVIII 的分子伴侣功能, 防止其快速降解、细胞摄取以及与活化的血小板和与内皮细胞表面的结合, 在游离状态下, FVIII 的半衰期从12 h 缩短到1～2 h[7]。vWF 分子包含复杂的多结构域即D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3=D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK, 新合成的vWF 前体分子经翻译后的加工, 包括信号肽和前肽的水解切除、糖基化修饰、硫化形成功能性多聚体[8] 。本文采用BDD-FVIII 基因, 于其分子的Ser1657 密码子前断裂为两部分, 分别与Ssp DnaB intein 融合后构建一对真核表达载体, 与vWF 基因共转染293 细胞, 探索vWF表达对intein 连接的BDD-FVIII 分泌和生物活性的影响, 旨在为提高基于intein 的BDD-FVIII 基因转移的效率以及进一步的体内甲型血友病动物模型的基因治疗研究提供依据。