千层塔中_型聚酮合酶基因的克隆_表达与功能鉴定

摘要: III 型聚酮合酶是以合成聚酮类化合物为主的一类重要生物合成酶。本文利用逆转录聚合酶链反应从中草药千层塔新鲜嫩叶中扩增聚酮合酶基因, 得到一个III 型聚酮合酶全长cDNA。该基因全长1 212 bp, 编码404个氨基酸。与已知的其他植物来源的聚酮合酶氨基酸序列有约50%～66%的同源性。cDNA 经双酶切后克隆至pQE81L, 并导入大肠杆菌 (E. coli) M15 中表达, 产生大量带寡聚组氨酸标记的重组酶, 重组酶分子质量大小约为46.4 kDa。酶活性鉴定研究表明, 该重组酶可催化芳香族底物、脂肪族底物生成系列非天然聚酮产物, 尤其是其可催化N-甲基邻氨基苯甲酰CoA 和丙二酰CoA 生成1, 3-二羟基-N-甲基-吖啶酮, 吖啶酮生物碱一直被认为只能由吖啶酮合酶合成。该工作为研究千层塔中III 型聚酮合酶在天然药物石杉碱甲生物合成中的作用奠定基础。

    千层塔 [Huperzia serrata (Thunb.) Trev.] 为我国名贵珍稀中药材, 从中分离得到的生物碱石杉碱甲(huperzine A, Hup A) 是一种高效、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂, 已成为国内外治疗早老性痴呆症最有效的药物之一[1, 2]。Hup A 的化学合成复杂, 至今无法实现工业化, 仍从日渐匮乏的野生千层塔中提取, 来源有限, 价格昂贵, 难以满足临床需要,其应用面临资源瓶颈。
    利用生物技术解决Hup A 的药源问题成为新的发展方向[3−5], 通过对Hup A 生物合成途径中关键酶基因的基因操纵与遗传转化, 实施次生代谢工程构建高效表达Hup A 或其重要前体的基因工程细胞株,是解决Hup A 药源问题最有前途的方法之一, 千层塔中的基因研究备受关注[4−6]。最近我国学者利用高通量测序技术对包括千层塔在内的药用植物进行基因研究, 试图为植物中活性成分的生物合成途径研究提供帮助[4, 5, 7]。Hup A 在结构上属于石松生物碱,根据石松生物碱 (包括Hup A) 的生物合成途径假说,洛伐他丁等)。按蛋白结构PKS 可分为Ⅰ、Ⅱ、III。PKSⅠ、Ⅱ存在于微生物界, 合成多烯类、聚醚类和安莎类聚酮化合物及合成大环内酯和芳香环结构的抗生素, PKS III 广泛存在于植物界, 属于查尔酮合成酶 (chalcone synthase, CHS) 类, 能催化产生一系列结构各异、具有不同生理活性的的植物次生代谢产物, 如生物碱 (吖啶酮)、类黄酮 (查尔酮、二苯乙烯、苯甲酮、间苯三酚、间苯二酚、吡喃酮、苯并-γ-吡喃酮等)。近年, 一系列功能不同的植物PKS III 不断被克隆和鉴定[10], 如芪合酶 (stilbene synthase, STS)、吡喃酮合酶 (2-pyrone synthase, 2PS)、苯甲酮合酶(benzalacetone synthase, BAS)、芦荟松合酶 (aloesone synthase, ALS) 、吖啶酮合酶 (acridone synthase,ACS)、聚八酮合酶 (octaketide synthase, OKS)、聚五酮色原酮合酶 (pentaketide chromone synthase, PCS)等。前期工作中, 作者已首次从千层塔中克隆得到一个全新编码III 型PKS 的cDNA 序列[6], 并进行了功能鉴定。本文报道千层塔中另一个III 型PKS 的成功克隆、表达和初步功能鉴定, 为下一步探索其在天然
药物Hup A 生物合成中的作用奠定基础。III 型聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS) 参与了
Hup A 的生物合成[8, 9]。PKS 是存在于微生物、植物中以合成聚酮类化合物为主的一类生物合成酶。聚酮类化合物在抗感染、抗肿瘤、抗真菌、免疫抑制方面具有巨大应用价值 (著名药物如红霉素、阿霉素、洛伐他丁等)。按蛋白结构PKS 可分为Ⅰ、Ⅱ、III。PKSⅠ、Ⅱ存在于微生物界, 合成多烯类、聚醚类和安莎类聚酮化合物及合成大环内酯和芳香环结构的抗生素, PKS III 广泛存在于植物界, 属于查尔酮合成酶 (chalcone synthase, CHS) 类, 能催化产生一系列结构各异、具有不同生理活性的的植物次生代谢产物, 如生物碱 (吖啶酮)、类黄酮 (查尔酮、二苯乙烯、苯甲酮、间苯三酚、间苯二酚、吡喃酮、苯并-γ-吡喃酮等)。近年, 一系列功能不同的植物PKS III 不断被克隆和鉴定[10], 如芪合酶 (stilbene synthase, STS)、吡喃酮合酶 (2-pyrone synthase, 2PS)、苯甲酮合酶(benzalacetone synthase, BAS)、芦荟松合酶 (aloesone synthase, ALS) 、吖啶酮合酶 (acridone synthase,ACS)、聚八酮合酶 (octaketide synthase, OKS)、聚五酮色原酮合酶 (pentaketide chromone synthase, PCS)等。前期工作中, 作者已首次从千层塔中克隆得到一个全新编码III 型PKS 的cDNA 序列[6], 并进行了功能鉴定。本文报道千层塔中另一个III 型PKS 的成功克隆、表达和初步功能鉴定, 为下一步探索其在天然药物Hup A 生物合成中的作用奠定基础。