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关键词：
羟基自由基(·OH),有机磷污染物,降解,pH值,正交试验
发表时间：
2012-08-22 11:24:31
摘 要:天然磷脂是含磷酸的类脂化合物,广泛存在于植物、动物及微生物体中,在工业生产、食品科学、医药学、生命科学等研究方面都有重要的应用。磷脂的研究手段多样,高效液相色谱在磷脂的分离、检测方面具有优势。本文结合近年来国内外高效液相色谱分离磷脂的研究报道,对高效液相色谱分离、检测磷脂的方法进行了分类、评价。关键词:天然磷脂;高效液相色谱法;分离;检测天然磷脂是含磷酸的类脂化合物,广泛存在于植物的种子,动物的脑、肝、卵和微生物体中。磷脂是细胞膜的主要成分,还是重要的生物活性物质及信息分子前体的贮备形式,与某些人类疾病有关,如炎症、糖尿病等[1,2]。在微生物学研究中,磷脂还是理想的生物标志物,通过磷脂分子组成可以揭示微生物生物量、群落组成和生理状况等信息[3,4],在生物地球化学研究中亦有重要意义。磷脂为兼性分子,可作乳化剂、稳定剂、和湿润剂[5]。可见,磷脂在工业生产、食品科学、医药学、生命科学、自然地理学等研究方面都有重要的应用,而对磷脂进行分离、提纯则是各种研究的前提和关键。对磷脂总量测定的方法有比色法、称重法、紫外分光光度法和红外光谱法,对磷脂进行分离、检测的方法有薄层色谱法、液相色谱、以及核磁共振法[6]。高效液相色谱分离磷脂可以避免破坏磷脂分子结构,得到更准确的分子结构信息,利用制备型液相色谱,还可获得纯度较高的单个组分[7],具有方便、快速、高灵敏度、无损伤的特点。高效液相色谱分析磷脂的困难在于磷脂分子的低挥发性、不耐高温、弱紫外吸收、易吸水、稳定性差等特点。不同来源的磷脂组成成分不同,分子中脂肪酸链长度、不饱和度亦有差别,磷脂分子本身的这种异质性会导致磷脂分离过程中出现色谱峰的延展、重叠、拖尾[8]。且在生物体中,磷脂一般与其他的脂类结合在一起,需化学手段进行分离、纯化、浓缩之后进行色谱分离、检测[9]。分离磷脂的液相色谱方法据固定相的不同分为正相色谱法和反相色谱法。正相色谱多用Silica硅胶柱为固定相,也有CN氰基柱、NH2氨基柱和DIOL二醇柱的报道[10,11,12]。反相色谱多以C18、C8、ODS[13,14]为固定相。正相色谱分离磷脂的基础是磷脂各组分的极性差异,反相色谱分离磷脂的基础则是各磷脂组分的疏水性差异。正相色谱分离磷脂常用的流动相有氯仿-甲醇-氨水、正己烷-异丙醇-水以及乙腈-甲醇-水[11]。磷脂在不同类型柱子上的保留存在差异,各组分的流出顺序也不同。如乙腈-甲醇-磷酸为流动相时,在硅胶柱上各组分流出顺序为PS、PE、PC、SP[15],而在氨基柱上的流出顺序为PC1、SP、PC2、PG、PE、PI、PS[11]。流动相也影响流出顺序,同在硅胶柱上,正己烷-异丙醇-水为流动相的流出顺序为:PE、PI、PC[8],而甲醇-乙腈-磷酸为流动相洗脱的流出顺序为PI、PE、PC[16]。PC、LPC溶血磷脂酰胆碱、SP的极性大,在硅胶柱上一般最后流出,SP通常为两个峰[8,17]。在分析弱酸、弱碱性的磷脂时,会出现峰延展、拖尾等现象,为了防止磷脂组分与固定相之间发生非特异性反应,损伤柱子,在流动相中添加一定量的离子抑制剂如85%磷酸、乙酸铵、30%氨水、乙酸等,可有效改善峰形,抑制色谱峰拖尾[1,12,1719]。但低pH可能会引起样品水解生成溶血磷脂[20]。反相色谱的流动相为甲醇-乙腈-水,有时也用到正己烷、异丙醇和氯仿[11]。在反相柱上分离磷脂,由于磷脂分子的异质性,一个组分会分成几个峰,给定量带来困难。如卢学清等测定熊胆中磷脂类化合物时,发现在PE-C18柱上PC、PG都分出双峰,还出现托尾、肩峰等问题[13]。但反相色谱与质谱检测器组合,可以实现磷脂的分离和痕量检测,检测限达ppm[4,12,21]。检测磷脂的检测器有紫外[15,17]、蒸发光散射[22]、示差折光[23]及质谱检测器[12]。磷脂虽然缺乏强发色团,但其分子结构中的不饱和基团和官能团(如碳碳双键、羰基、磷酸基团、氨基)在2002214nm下有强吸收,检测波长一般在203nm或205nm。但Suchocka认为磷脂的检测范围在2002237nm,并分别在235nm和254nm处检测磷脂,在C8柱上分离了PC、PE、LPC、PI[24]。磷脂的紫外吸收强度与分子结构中有无发色团、发色团数目有关,如含氨基的PC、PE、PS紫外吸收就大,缺乏发色团的PI紫外吸收就弱,色谱图中信号的强度并不能代表绝对的磷脂浓度[25]。将磷脂分子进行衍生化可增大磷脂的紫外吸收,降低检测限。通过化学反应将磷脂变成具有发色基团的化合物,或直接在磷脂分子上连接发色团或荧光基团,再用紫外或荧光检测器进行检测[26]。但是衍生化反应过程复杂,前处理步骤繁琐,对定量结果的准确度影响较大,操作繁琐。蒸发散射光检测器和质谱检测器均为非选择型的检测器,应用不受样品种类限制。但蒸发光散射检测器对溶剂要求高,线形较差,且灵敏度较紫外检测器低[11,25]。杨亦文等研究发现紫外检测器受磷脂来源影响较大,难以实现准确定量。而示差折光检测器受来源影响较小,但灵敏度较低,不能用于梯度洗脱,且对环境要求高,受温度影响较大[23]。质谱检测器成本较高,但可大大降低检测限,并可得到分子结构信息,是目前国内外研究的热点[27]。分离流速一般在0.152.0mL/min,多为1.0mL/min,制备色谱流速一般为2.0mL/min,连接质谱检测器时流速小,一般为0.150.5mL/min。简单样品等度洗脱即可以完成分离,复杂样品则需梯度洗脱,通过改变溶剂的配比从而改变溶剂的极性来完成对极性差异很大的样品的快速、完全分离[7,12]。
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