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关键词：
麦汁,煮沸,凝固氮
发表时间：
2012-12-28 09:46:26
基于磁性颗粒微阵列与双色荧光杂交的单核苷酸多态性分型方法研究
金敏 | -> | 815| 0| 0.404798MB |磁性颗粒微阵列,不对称扩增,双色荧光杂交,单核苷酸多态性
摘要基于磁性颗粒微阵列与双色荧光杂交，建立了单核苷酸多态性( Single nucleoitide polymorphism，SNP) 分型方法。将利用不对称扩增得到的含有待检测位点生物素标记的单链PCR 产物固定在链亲和素修饰的金磁纳米颗粒( Gold magnetic nanoparticles，GMNPs) 表面; 将ssDNA-GMNPs 混合物点样在底部固定有磁铁的载玻片上构建磁性颗粒微阵列，然后在基因框中与双色荧光探针杂交; 杂交完全后，充分洗涤，通过扫描获得分型结果。通过优化不对称PCR 的扩增条件，直接扩增出产量较高的单链DNA 作为靶序列用于分型。利用本方法对24 个样本MTHFR 基因的C677T 位点多态性进行了检测。实验证明，本方法步骤简单，易实现自动化操作、非常适用于分子诊断与法医鉴定。
对来自病人和对照组的上千乃至上万个样本的多个( SNP) 位点进行分型研究时［1］，相应的检测技术应该具有高通量、自动化、低成本等特点。目前，基因芯片由于具有高通量、高灵敏和并行检测的特点［2，3］，已广泛用于发现疾病相关基因、建立疾病诊断指标和基础生物学及医学研究领域［4，5］。
由于磁性纳米粒子具有特殊的物理化学性质和生物相容性［6］，目前已被广泛应用于核酸提取［7 ～ 9］与核酸检测［10 ～ 13］中。Lien 等［12］基于磁珠的微流体平台，实现了DNA 提取与SNP 分型; Nakagawa 等［13］利用功能化的磁性纳米粒子提取DNA，通过荧光融解曲线法实现了对ALDH2 基因SNP 的自动化检测，但是该方法耗时，且不易实现高通量检测。本课题组也建立了一系列基于磁分离的核酸检测方法［14， 15］，以磁性纳米粒子为杂交靶序列的载体，成功避免了杂交的分型技术中对靶序列纯化和浓缩而导致的费时、费力等缺陷，具有成本低、操作快速、简便、准确等优点。但是由于所使用的链亲和素修饰的磁性纳米粒子具有非常高的荧光背景，所以只能将变性的荧光探针点样到干净的载玻片上构建芯片，再进行扫描、分型，增加了操作的复杂性。同时，由于不同样本需要在不同的反应管中杂交，增加了检测成本。
本实验在磁性纳米材料表面修饰金壳，有效消除了磁性纳米颗粒的荧光背景。利用磁性颗粒微阵列与双色荧光探针杂交相结合，对MTHFR 基因C677T 位点的多态性进行了检测。通过在基因框中对多个样本同时杂交，显著降低了对于每个样本杂交所需Cy3，Cy5 标记荧光探针的用量。在获得较好的分型结果的同时，进一步简化了实验步骤，拓展了适用范围，更适合于自动化分析。
由于磁性纳米粒子具有特殊的物理化学性质和生物相容性［6］，目前已被广泛应用于核酸提取［7 ～ 9］与核酸检测［10 ～ 13］中。Lien 等［12］基于磁珠的微流体平台，实现了DNA 提取与SNP 分型; Nakagawa 等［13］利用功能化的磁性纳米粒子提取DNA，通过荧光融解曲线法实现了对ALDH2 基因SNP 的自动化检测，但是该方法耗时，且不易实现高通量检测。本课题组也建立了一系列基于磁分离的核酸检测方法［14， 15］，以磁性纳米粒子为杂交靶序列的载体，成功避免了杂交的分型技术中对靶序列纯化和浓缩而导致的费时、费力等缺陷，具有成本低、操作快速、简便、准确等优点。但是由于所使用的链亲和素修饰的磁性纳米粒子具有非常高的荧光背景，所以只能将变性的荧光探针点样到干净的载玻片上构建芯片，再进行扫描、分型，增加了操作的复杂性。同时，由于不同样本需要在不同的反应管中杂交，增加了检测成本。
本实验在磁性纳米材料表面修饰金壳，有效消除了磁性纳米颗粒的荧光背景。利用磁性颗粒微阵列与双色荧光探针杂交相结合，对MTHFR 基因C677T 位点的多态性进行了检测。通过在基因框中对多个样本同时杂交，显著降低了对于每个样本杂交所需Cy3，Cy5 标记荧光探针的用量。在获得较好的分型结果的同时，进一步简化了实验步骤，拓展了适用范围，更适合于自动化分析。
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