人酸性成纤维细胞生长因子与穿膜肽融合蛋白在鼠体内的药代动力学及血脑屏障通透性研究

摘要: 研究穿膜肽 (tranional activator protein, TAT) 和人酸性成纤维细胞生长因子 (human acidic fibroblast growth factor, haFGF) 融合蛋白TAT-haFGF14−154静脉注射 (iv) 后在大鼠血浆中的药代动力学特性, 并探讨其在大鼠和小鼠体内血脑屏障的通透性, 为阿尔茨海默症 (Alzheimer’s disease, AD) 的临床治疗用药提供依据。酶联免疫吸附实验 (ELISA) 检测静脉注射后TAT-haFGF14−154 在大鼠血浆和小鼠脑匀浆液的含量, 免疫组织化学法检测大鼠和小鼠脑中的分布。结果表明, 大鼠单次颈静脉注射TAT-haFGF14−154 300 μg·kg−1 后, 血药浓度-时间曲线符合二室开放模型, 加权为1/C2, 属于线性动力学消除, 其中, 分布半衰期为 (0.049 ± 0.03) h, 消除半衰期为 (0.55 ± 0.05) h。结果提示, TAT-haFGF14−154 在体内消除较快, 可以迅速穿过血脑屏障, 分布于大脑皮质和海马区, 并定位于细胞核。

    人酸性成纤维细胞生长因子 (human acidic fibroblast growth factor, haFGF) 在神经系统方面具有多种生物学功能。临床研究表明: haFGF 对脊髓损伤患者具有神经修复功能[1]; 另外, haFGF 可以抑制中枢神经元的凋亡, 促进轴突修复, 减少海马细胞的缺失和神经元的变性[2]。野生型haFGF 由154 个氨基酸残基构成, 在天然状态下, haFGF N 端不稳定,部分氨基酸残基易降解。本实验中采用的haFGF14−154是将野生型haFGF 去除N 端13 个不稳定氨基酸的改构体, 研究表明, haFGF14−154 在显著提高稳定性的同时, 保留了野生型haFGF 的促分裂和非促分裂等多种生物学功能。
    阿尔茨海默症 (Alzheimer’s disease, AD) 是一种常见的中枢神经系统退行性疾病, 其主要病理特征包括在大脑皮层和海马出现β-淀粉样蛋白(amyloid-β protein, Aβ) 聚集形成的老年斑 (SP), Tau蛋白异常磷酸化聚集形成的神经纤维缠结 (NFT) 以及大脑皮层和海马区神经细胞减少[3]。目前的治疗药物只能缓解AD 患者的症状, 无法从根本上治疗。基于haFGF 在神经系统方面的多种功能, 使其具有开发成为治疗AD 新型药物的良好前景。
    然而haFGF 分子量较大, 难以穿过血脑屏障, 从而阻碍了其发挥脑部疾病治疗的作用。穿膜肽TAT(tranional activator protein) 是一种带正电荷的短肽, 它可以携带多种大分子物质穿过细胞膜运送到细胞内。近年来, 将穿膜肽与蛋白药物融合, 利用TAT 介导大分子到达脑部的报道日趋增多: Cai 等[4]利用穿膜肽介导分子质量较大 (17 kD) 的脑红蛋白进入小鼠脑内, 保护受损大脑; 研究表明: TAT-FNK、TAT-Bcl-xL、TAT-GDNF、TAT-XIAP、TAT-Hsp70等均可以穿过未受损的血脑屏障, 发挥对脑部疾病的治疗作用[5−9]。而本实验室前期研究表明: haFGF改构体对Aβ 所致大鼠海马神经元细胞毒性具有显著的保护作用, 与TAT 融合可以快速穿过PC12、HaCaT 和海马神经元等细胞的细胞膜[10]。综上所述,由于穿膜肽具有可以携带多种大分子物质穿过细胞膜进入细胞的特性, 为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光[11], 本实验将考察TAT 与haFGF 的融合蛋白静脉用药后在鼠体内的药代动力学特点及其血脑屏障通透性, 旨在为其临床应用提供参考。