脱氧萎镰菌醇通过下调GRP78提高双链转FV_基因细胞分泌重链和生物活性

赵虎 | -> | 1422| 0| 0.803634MB |凝血VIII因子,双链转基因,脱氧萎镰菌醇,重链分泌

摘要: 双链转凝血VIII 因子 (FVIII) 基因是克服AAV 载体容量限制的有效方法, 但重链分泌的低效性带来链不均衡性。本文旨在用脱氧萎镰菌醇 (deoxynivalenol, DON) 降解内质网分子伴侣蛋白GRP78, 通过减少重链与GRP78 的结合提高重链分泌, 改善双链转FVIII 基因的功效。用DON 处理双链共转基因细胞, 观察了双链转FVIII 基因293 细胞分泌的重链和FVIII 活性。结果显示, 用500 ng·mL−1 DON 处理细胞3 h 后, GRP78 蛋白水平明显降低, 细胞的生长不受明显影响; 单独转FVIII 重链基因的DON 处理细胞分泌的重链量 [ (59 ± 11) ng·mL−1]明显高于对照细胞 [ (15 ± 4) ng·mL−1], 双链共转基因时重链的分泌量进一步增加, 为 (146 ± 34) ng·mL−1, 活性达到 (0.66 ± 0.15) U·mL−1, 明显高于双链转基因对照细胞 [分别为 (76 ± 17) ng·mL−1 和 (0.35 ± 0.09) U·mL−1]。结果表明, DON 可通过下调GRP78 改善重链的分泌性, 提高双链转FVIII 基因的功效, 为进一步动物体内双AAV 载体转FVIII 基因提供了实验依据。

凝血因子VIII (coagulation factor VIII, FVIII) 缺陷导致的甲型血友病占血友病患者总数的80%～85%, 基因治疗被认为是甲型血友病的根治疗法[1, 2]。持续、稳定的FVIII 表达是基因治疗成功的关键, 在已开发的基因载体中, 腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV) 载体由于具有非致病性、复制缺陷和介导转基因稳定表达等特点, 是基因治疗的理想载体。但AAV 载体的主要缺陷是其包装容量的限制 (4.7 kb),难于运载较大的FVIII 基因[3]。双载体分别转FVIII的重链和轻链基因是克服AAV 载体容量限制的一种有效方法, 但功效有赖于靶细胞共转染双链基因的效率, 且由于重链分泌低效性所致的过量无功能轻链具有潜在产生抑制性抗体的可能[4]。研究表明,FVIII 分泌低效的原因主要是由于其分子的重链与内质网腔中分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78 (glucoseregulated
protein 78, GRP78) 的结合[5]。作者最近的研究显示, 通过重链的L303E/F309S 点突变抑制其
与GRP78 的结合可提高细胞内经蛋白质剪接的FVIII分泌[6]。
脱氧萎镰菌醇 (deoxynivalenol, DON) 是一种在谷类食品中由镰刀霉菌产生的单端孢霉烯毒枝菌素,其结构如图1 所示[7]。DON 具有多种生物活性, 有研究表明, DON 可通过诱导GRP78 的降解下调细胞内GRP78 水平[8]。为观察GRP78 下调对双载体转B 区缺失型FVIII (BDD-FVIII) 后重链分泌和转基因功效的影响, 本研究用DON 处理双载体转基因细胞, 表明可明显提高重链的分泌和活性。

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