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关键词：
荧光关联谱,数据处理,微分曲线,估测参数,多荧光组分
发表时间：
2011-12-22 14:28:18
摘 要 荧光关联谱方法凭借其独特的对溶质浓度及扩散系数的测量能力, 在对复杂系统的分子物理化学性质测量方面, 不断扩大和深化其应用领域。但是从经典上, 传统的荧光关联谱数据处理方法容易在拟合自相关曲线的参数时引入一定的误差, 而且图表上的直观信息不多。针对以上问题, 在文章中作者尝试用带有微分的数据处理办法, 来更直观地估测参数并判断荧光多组分问题。经典自相关曲线处理后的微分曲线, 有特异的波谷位置、深度和半深宽度, 由此可判断特征扩散时间和多荧光成分的组分数目。此改进方法为利用荧光涨落谱方法测量生物组织体内的复杂环境提供帮助。
荧光关联谱(fluorescence correlation spect roscopy , FCS)方法是一项近年来发展迅速的实验方法, 已经在化学、生命科学等领域逐渐显示出它广阔的应用前景[1 , 2 ] 。荧光关联谱技术测量的是粒子位于一个非常小的激光激发区域时所发出的荧光, 通过分析荧光光强涨落数据的自相关函数得到粒子扩散系数、溶液浓度等信息。荧光关联谱测量与传统的测量方法比较, 其优点主要在于: 很高的灵敏度(可以达到单分子探测的水平) ; 测量对系统基本无干扰; 可以进行实时监测等。这些优点尤其适用于生物科学的研究[3-5 ] 。
但是, 目前绝大多数FCS 实验的数据处理办法还是几十年前的方法。这种在横坐标采用对数坐标的图中拟合自相关曲线的方法虽然经典, 但是一些信息不能直观的准确得到,如特征扩散时间τD 和溶液荧光组分个数这些参数。拟合曲线时, 实验者需要根据自相关曲线形状估计τD , 再作为拟合参数的初始值。特征扩散时间对数据曲线形状极敏感, 数据质量差会导致特征扩散时间有很大的不确定度[6 ] 。而FCS 方法对复杂体系, 如生物样品, 容易产生背景叠加[7 ] , 强光导致的三重态和漂白效应[8 ] 等系统误差, 导致曲线质量的下降。另一方面, FCS 方法对多组分样品的识别率较低。目前在信噪比很好[9 ] 而且各组分的特征扩散时间相差一个量级以上的情况下, 自相关曲线最多可以进行三组分拟合, 更多组分的拟合人眼几乎不能识别, 而且计算机拟合时有很多发散值, 无法进行。更重要的是即使计算机可以多组分拟合该曲线, 很多时候, 实验者无法直观从自相关曲线上判断荧光组分的数目, 也就无法进行下一步的参数拟合。这是因为不同荧光组分数目的问题有不同的拟合公式, 对同一数据用错误
公式拟合的结果完全不确定。所以如何判断样品中组分的个数是一个很麻烦的问题。而通过本文中对对数坐标图中自相关曲线求导, 会比直接观察法便于识别组分的个数。
本文主要针对上述问题, 从数据处理角度提出一些改进办法。通过理论计算, 在处理过的自相关曲线的微分曲线上, 挖掘其物理含义和作用。在比较中发现该方法比传统方法的优势, 并通过实验实例证实了该改进方法的效果。
但是, 目前绝大多数FCS 实验的数据处理办法还是几十年前的方法。这种在横坐标采用对数坐标的图中拟合自相关曲线的方法虽然经典, 但是一些信息不能直观的准确得到,如特征扩散时间τD 和溶液荧光组分个数这些参数。拟合曲线时, 实验者需要根据自相关曲线形状估计τD , 再作为拟合参数的初始值。特征扩散时间对数据曲线形状极敏感, 数据质量差会导致特征扩散时间有很大的不确定度[6 ] 。而FCS 方法对复杂体系, 如生物样品, 容易产生背景叠加[7 ] , 强光导致的三重态和漂白效应[8 ] 等系统误差, 导致曲线质量的下降。另一方面, FCS 方法对多组分样品的识别率较低。目前在信噪比很好[9 ] 而且各组分的特征扩散时间相差一个量级以上的情况下, 自相关曲线最多可以进行三组分拟合, 更多组分的拟合人眼几乎不能识别, 而且计算机拟合时有很多发散值, 无法进行。更重要的是即使计算机可以多组分拟合该曲线, 很多时候, 实验者无法直观从自相关曲线上判断荧光组分的数目, 也就无法进行下一步的参数拟合。这是因为不同荧光组分数目的问题有不同的拟合公式, 对同一数据用错误
公式拟合的结果完全不确定。所以如何判断样品中组分的个数是一个很麻烦的问题。而通过本文中对对数坐标图中自相关曲线求导, 会比直接观察法便于识别组分的个数。
本文主要针对上述问题, 从数据处理角度提出一些改进办法。通过理论计算, 在处理过的自相关曲线的微分曲线上, 挖掘其物理含义和作用。在比较中发现该方法比传统方法的优势, 并通过实验实例证实了该改进方法的效果。
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