结直肠癌组织中K_ras基因突变的毛细管电泳检测

摘要: 通过对PCR 扩增的76 例结直肠癌组织及癌旁正常组织DNA 基因组共152 个样本纯化变性后，采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测( CE-LIF) 结合单链构象多态性( SSCP) 分析方法检测了人结直肠癌组织及癌旁正常组织中K-ras 基因第12 /13 位密码子突变。所检测的76 例结直肠癌患者中有30 例患者存在基因突变，并对异常片段进行测序验证，测序证实以碱基G→A 点突变为主。结果表明所建立的CE-LIF 技术结合SSCP 分析检测K-ras 基因突变的方法高效、快速、灵敏、准确，适合于临床上大样本结直肠癌中K-ras 基因突变分析，对选择抗结直肠癌药物有一定的指导作用。

    K-ras 基因是ras 基因家族中3 种癌基因的一种，为表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EGFR) 信号传导通路的下游基因，与结直肠癌关系密切［1］。我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，且发病率已达5%，高于2% 的国际水平; 每年新发病例约40 万，其中30 ～ 40 岁的中年人居多。各个国家和地区的结直肠癌中K-ras 基因突变率并不相同，欧美为30% ～ 68%［2，3］，而中国为14%～ 43. 8%［4，5］。K-ras 基因最常见的激活方式是点突变，其中90%发生在第一外显子的第12、13 位密码子上，其中70%发生于第12 位密码子， 30% 发生于第13 位密码子［6］; 极少文献报道第19、61、63位密码子发生突变。第12、13 位密码子常用的检测方法主要有DNA 测序［7］。根据结直肠癌患者中Kras基因是野生型还是突变型，将传统意义上的一种疾病分成两种独立的疾病进行治疗。结直肠癌患者中K-ras 基因为突变型的约占40%，而其余60% 左右的K-ras 基因为野生型，目前临床治疗中抗EGFR靶向药物对K-ras 野生型大肠癌患者疗效显著，而对突变型无效，如不加区分采取同一种药物治疗将会增加不良反应风险和治疗费用。因此，对K-ras突变类型的检测［7 － 13］，可以筛选出抗EGFR 靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。临床统计分析发现，大肠原发病灶的患者手术后5 年复发转移率较高，即病情分期越晚者复发转移的风险越高。早期检测K-ras 基因，可早期治疗，从而有效降低病人复发转移的风险。因此，检测K-ras 基因第12 /13 位密码子的突变情况，对于结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预后有重要意义。
    本实验采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测( CE-LIF) 结合单链构象多态性( SSCP) 技术，采用作者所在课题组已建立的CE-SSCP 方法检测了临床结直肠癌手术标本和经福尔马林固定石蜡包埋
( FFPE， formalin-fixed and paraffin-embedded) 同一组织标本中K-ras 基因第12 /13 位密码子突变，并应用DNA 直接测序法进行验证，其结果可为结直肠癌的临床诊断和治疗提供科学理论依据。