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关键词：
聚丙烯,极性单体,Ziegler-Natta催化剂,二醚,聚烯烃功能化
发表时间：
2012-07-12 16:20:08
脱氧核糖核酸_蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用
杨晶 | -> | 1444| 0| 0.584026MB |脱氧核糖核酸,蛋白质,相互作用,无胶筛分毛细管电泳,激光诱导荧光检测,聚环氧乙烷,胃癌组织
摘要建立了无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光( Non-gel sieving capillary electrophoresis with laser inducedfluorescence，NGS-CE-LIF) 检测脱氧核糖核酸( DNA) -蛋白质相互作用产物的方法。考察了筛分介质聚环氧乙烷( Poly ( ethylene oxide) ，PEO) 浓度、分离温度、分离电压及缓冲液三羟甲基氨基甲烷硼酸( Tris-Borate-EDTA，TBE) pH 值等条件对pUC19 DNA/MspⅠ( HpaⅡ) DNA Marker 和Protein Molecular Weight Marker ( Broad)D532S 相互作用产物的影响。结果表明，当PEO 浓度为0． 1%，TBE 的pH 为9． 0，分离电压为15 kV，分离柱温15 ℃时，DNA-蛋白质相互作用产物得到有效分离。本方法应用于人胃癌组织p53 基因扩增后的PCR 产物和从相应组织中提取的蛋白质二者相互作用产物时，检测效率高，分离效果好。
蛋白质和核酸是构成生命体最为重要的两类生物大分子，脱氧核糖核酸( DNA) -蛋白质相互作用的研究是21 世纪生命科学研究的主要课题之一，涉及多学科前沿交叉领域的相关知识和技术方法。过去的研究主要集中在宏观认识方面，近年来，研究者综合各种手段并采用先进的仪器在微观上取得一些可喜的成果［1，2］，但目前仍处于探索阶段。弄清DNA-蛋白质相互作用的机制，对于了解DNA 转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。
采用无胶筛分毛细管电泳( Non-Gel sieving capillary electrophoresis，NGS-CE) 分析核酸和蛋白质已有报道［3，4］，但将其用于DNA-蛋白质相互作用的研究较少。研究分子间相互作用是毛细管电泳( Capillary electrophoresis，CE) 的一个重要应用领域［5 ～ 8］，对于一个相互作用体系，只要游离配体( 或受体) 和结合物之间存在荷质比的差异，理论上讲，都可以在电场下将它们分离，而实际的分离效果则取决于CE的模式、电场强度、温度、毛细管的内壁状况等因素。在CE 研究分子间相互作用中，最常用的检测手段是紫外和激光诱导荧光( Laser induced fluorescence，LIF) ，激光诱导荧光通常要比紫外检测的灵敏度高出10 ～ 1000 倍，并且CE 信号干扰低，但需要进行荧光标记。研究DNA-蛋白质相互作用的荧光法，主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的检测技术，此法对待测物质的浓度要求低，灵敏度高且部分荧光技术可实现对待测物质的动态分析等。Wan 等［9］利用毛细管电泳激光诱导荧光( Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence，CELIF)技术研究了单链DNA 结合蛋白质的反应，CE-LIF 结果显示不同核苷酸标记的荧光探针因与蛋白质结合的强弱不同，使得DNA-蛋白质复合物的计量系数不同，从而得以区分。
SYBR Green I 和异硫氰酸荧光素( Fluorescein isothiocyanate，FITC) 是两种常用的荧光衍生试剂，前者常用于核酸的标记，后者则用于对蛋白质的标记。本实验分别以二者为柱前衍生试剂，PEO 为筛分介质［10］，1 × TBE 为电泳缓冲溶液，对DNA 和蛋白质进行NGS-CE 分析。以SYBR Green I 标记DNA 标准物( pUC19 DNA/MspⅠ( HpaⅡ) DNA Marker ( 26 ～ 501 bp) ) 和蛋白质标准物( Protein Molecular Weight Marker ( Broad) D532S( 6． 5 ～ 200 kDa) ) 共同孵育后的混合物，以DNA 和蛋白质标准物为材料，对DNA-蛋白质相互作用产物的方法学及实验条件进行考察，将其用于提取的胃癌组织基因和蛋白质相互作用产物的检测，探讨DNA-蛋白质相互作用的机制，并以DNA 为“诱饵”，得到一种检测蛋白质的方便、有效、快速的方法。
采用无胶筛分毛细管电泳( Non-Gel sieving capillary electrophoresis，NGS-CE) 分析核酸和蛋白质已有报道［3，4］，但将其用于DNA-蛋白质相互作用的研究较少。研究分子间相互作用是毛细管电泳( Capillary electrophoresis，CE) 的一个重要应用领域［5 ～ 8］，对于一个相互作用体系，只要游离配体( 或受体) 和结合物之间存在荷质比的差异，理论上讲，都可以在电场下将它们分离，而实际的分离效果则取决于CE的模式、电场强度、温度、毛细管的内壁状况等因素。在CE 研究分子间相互作用中，最常用的检测手段是紫外和激光诱导荧光( Laser induced fluorescence，LIF) ，激光诱导荧光通常要比紫外检测的灵敏度高出10 ～ 1000 倍，并且CE 信号干扰低，但需要进行荧光标记。研究DNA-蛋白质相互作用的荧光法，主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的检测技术，此法对待测物质的浓度要求低，灵敏度高且部分荧光技术可实现对待测物质的动态分析等。Wan 等［9］利用毛细管电泳激光诱导荧光( Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence，CELIF)技术研究了单链DNA 结合蛋白质的反应，CE-LIF 结果显示不同核苷酸标记的荧光探针因与蛋白质结合的强弱不同，使得DNA-蛋白质复合物的计量系数不同，从而得以区分。
SYBR Green I 和异硫氰酸荧光素( Fluorescein isothiocyanate，FITC) 是两种常用的荧光衍生试剂，前者常用于核酸的标记，后者则用于对蛋白质的标记。本实验分别以二者为柱前衍生试剂，PEO 为筛分介质［10］，1 × TBE 为电泳缓冲溶液，对DNA 和蛋白质进行NGS-CE 分析。以SYBR Green I 标记DNA 标准物( pUC19 DNA/MspⅠ( HpaⅡ) DNA Marker ( 26 ～ 501 bp) ) 和蛋白质标准物( Protein Molecular Weight Marker ( Broad) D532S( 6． 5 ～ 200 kDa) ) 共同孵育后的混合物，以DNA 和蛋白质标准物为材料，对DNA-蛋白质相互作用产物的方法学及实验条件进行考察，将其用于提取的胃癌组织基因和蛋白质相互作用产物的检测，探讨DNA-蛋白质相互作用的机制，并以DNA 为“诱饵”，得到一种检测蛋白质的方便、有效、快速的方法。
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