药品无菌检查中微生物污染的鉴定和污染溯源分析

摘要目的: 本研究结合无菌药品受微生物污染的案例，通过多种技术手段分析药品微生物污染情况，保证药品无菌检验结果判断的准确性，对药品微生物污染追踪溯源提供技术支持。方法: 对从无菌检查阳性样品和实验环境中分离得到14 株革兰氏阳性球菌进行鉴定和分型，采用VITEK 2 Compact、16S rRNA 基因测序技术、RiboPrinter 系统以及DiversiLab 系统等手段对微生物进行同源性分析。结果: 无菌阳性样品中分离出的微生物经鉴定为3 株溶血葡萄球菌、4 株沃氏葡萄球菌和5 株表皮葡萄球菌，从环境中得到2 株表皮葡萄球菌。由同源性分析可知，来源于不同产地的样品中分离出来的同种微生物亲缘关系较远，来源不同，与环境中收集到的微生物不相关。若仅考虑现有收集到的环境监控菌，污染源是样品在加工或运输过程中引入的，与无菌检查环境无关。结论: 通过对14 株葡萄球菌的鉴定和溯源分析，综合评价多种技术手段的分型效果，以完善药品无菌检查过程控制，为药品微生物污染的溯源调查提供解决方案。

    药品微生物无菌检查是药品质量中对微生物限量的最高要求，任何微生物的存活对于用药者而言都可能是致命的存在。我国早在1953 年版中国药典就收载无菌检查方法，经历数次修订，2010 年版中国药典不仅完善了无菌检查方法，还将无菌检查的药品范围扩大到所有眼用制剂和烧伤或严重创伤的外用剂型［1］。这为加强我国药品质量，降低药品微生物污染风险起到了推动作用。
    但是，无菌检查法作为终产品检查法虽能防止问题产品流向消费领域，却无法对药品检验进行过程控制，无法解决药品微生物污染来源问题，也无法向监管机构提供有效的微生物风险评估和风险管理的信息。随着技术的进步，分子生物学技术在微生物鉴定和分型领域得到广泛的认可和应用，包括聚合酶链式反应( PCR) 技术、DNA 测序技术［2，3］、脉冲场电泳( PFGE) 技术［4］、核糖体分型( RiboTyping) 技术［5］、重复序列PCR( Rep － PCR) 分型技术［6］和多位点序列分析( MLST) 技术［7］等。尤其是自动化仪器的出现，克服了微生物分型手工操作烦琐、稳定性
差的问题，极大地缩短了检验时间［8］。研究表明，全自动的分型技术( RiboPrinter 和iversiLab 等) 虽然分辨率较PFGE 稍差，但比PFGE 的耗时缩短一半以上，且灵敏度和重复性则有较大提高［5，9］。另外，充分利用各种分子生物学分型技术，可以为微生物溯源调查提供可信的标准化数据支持［10 ～ 12］。而我国还未建立起有效的药品无菌检查微生物污染溯源调查方法和判断依据。
    对来自不同产地的多批药品进行无菌检查，连续出现多批样品无菌检查阳性结果。对阳性样品中的微生物进行胰蛋白胨大豆琼脂( TSA) 平板分离培养后得到12 株细菌革兰氏阳性球菌。在实验过程中，TSA 沉降平板亦收集到2 株革兰氏阳性球菌。因此，怀疑检测环境受到微生物污染，影响无菌检查结果。本实验通过采用多种国际先进的微生物鉴定和溯源方法( VITEK 2 Compact、16S rRNA 基因测序技术、RiboPrinter 系统以及DiversiLab 系统) ，对这14 株革兰氏阳性球菌进行详细的菌种鉴定和基因分型，分析无菌检查过程中微生物污染来源，判断样品的无菌检验结果。