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关键词：
生化,HPLC,同时,测定,复方,草酸,囊中,氨酸,氨酸,含量,
发表时间：
2010-12-06 16:06:20
以双氯酚酸为探针采用高效液相色谱法快速测定CYP450 2C9的酶活性
药学学报 | -> | 3912| 0| 0.262531MB |探针,采用,高效,快速,测定,活性,
摘 要:目的 建立一种快速、高效的以双氯酚酸作为探针药物评价细胞色素P450 2C9 (CYP2C9)酶活性的高效液相色谱-紫外检测方法。方法 色谱柱为Agilent Zorbax SB2C18柱(50mm ×4. 6mm I. D. , 5μm) ;流动相为乙腈(含0. 01%七氟丁酸) -水(含0. 01%七氟丁酸) (65∶35,V /V) ,流速2. 0mL /min;检测波长为280nm。双氯酚酸与人CYP2C9酶在37℃温孵适当时间后,加入100μL乙腈2冰乙酸(94∶6,V /V)终止反应, 10 000g离心后取上清液进样分析测定。结果 4’2羟基双氯酚酸的保留
时间为1. 35min,线性范围为1. 00～200μmol·L - 1 ( r = 0. 999 9) ,最低定量限为1.00μmol·L - 1 ,回收率为99. 5% ～100. 8%;双氯酚酸的保留时间为2. 25min,线性范围为1. 00～200μmol·L - 1 ( r = 0. 999 9) ,最低定量限为1. 00μmol·L - 1 ,回收率为99. 3% ～101. 1%。两者的日内、日间RSD均< 15% ,温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定。结论 该方法快速、稳定、灵敏度高,适合体外双氯酚酸及其代谢物4’2羟基双氯酚酸的测定,可应用于体外CYP2C9酶活性的评价及酶动力学的研究。
时间为1. 35min,线性范围为1. 00～200μmol·L - 1 ( r = 0. 999 9) ,最低定量限为1.00μmol·L - 1 ,回收率为99. 5% ～100. 8%;双氯酚酸的保留时间为2. 25min,线性范围为1. 00～200μmol·L - 1 ( r = 0. 999 9) ,最低定量限为1. 00μmol·L - 1 ,回收率为99. 3% ～101. 1%。两者的日内、日间RSD均< 15% ,温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定。结论 该方法快速、稳定、灵敏度高,适合体外双氯酚酸及其代谢物4’2羟基双氯酚酸的测定,可应用于体外CYP2C9酶活性的评价及酶动力学的研究。
细胞色素P450 2C9 (CYP2C9)是最重要的P450酶之一,约占肝微粒体CYP450总量的20%。参与
多类药物的代谢,因此准确地评价CYP2C9的酶活性十分重要[ 1～3 ] 。降糖药甲苯磺丁脲4-羟化代谢是最常用的CYP2C9探针底物,但CYP2C9抗体仅抑制了78%～93%的甲苯磺丁脲42羟化代谢,余下的反应活性与CYP2C19有关[ 4 ] 。CYP2C19在正常肝脏中的含量远低于CYP2C9,因此它在甲苯磺丁脲4-羟化代谢中的作用可以被忽略。但在CYP2C9缺陷人群, CYP2C19对甲苯磺丁脲的催化作用不容忽视。二氯芬酸4’2羟化代谢也常用来检测CYP2C9活性。利用cDNA表达的CYP2C9酶和CYP2C9抑制剂, 证实二氯芬酸4 ’-羟化代谢几乎完全由CYP2C9介导[ 5、6 ] 。因此本研究在体外CYP2C9 活
性研究中,选用双氯酚酸作为CYP2C9的探针底物,通过体外代谢测定其在P450 酶中的代谢物4’2羟
基双氯酚酸(双氯酚酸4’-羟基化反应, Diclofenac4’2hydrolation) ,来评价CYP 2C9酶的活性。本研究建立了快速、高效、稳定的测定CYP450 2C9酶孵育体系中双氯酚酸和4’-羟基双氯酚酸的RP-HPLC,该法能同时对代谢产物及双氯酚酸在CYP450 2C9酶孵育体系中代谢的酶动力学进行分析。
多类药物的代谢,因此准确地评价CYP2C9的酶活性十分重要[ 1～3 ] 。降糖药甲苯磺丁脲4-羟化代谢是最常用的CYP2C9探针底物,但CYP2C9抗体仅抑制了78%～93%的甲苯磺丁脲42羟化代谢,余下的反应活性与CYP2C19有关[ 4 ] 。CYP2C19在正常肝脏中的含量远低于CYP2C9,因此它在甲苯磺丁脲4-羟化代谢中的作用可以被忽略。但在CYP2C9缺陷人群, CYP2C19对甲苯磺丁脲的催化作用不容忽视。二氯芬酸4’2羟化代谢也常用来检测CYP2C9活性。利用cDNA表达的CYP2C9酶和CYP2C9抑制剂, 证实二氯芬酸4 ’-羟化代谢几乎完全由CYP2C9介导[ 5、6 ] 。因此本研究在体外CYP2C9 活
性研究中,选用双氯酚酸作为CYP2C9的探针底物,通过体外代谢测定其在P450 酶中的代谢物4’2羟
基双氯酚酸(双氯酚酸4’-羟基化反应, Diclofenac4’2hydrolation) ,来评价CYP 2C9酶的活性。本研究建立了快速、高效、稳定的测定CYP450 2C9酶孵育体系中双氯酚酸和4’-羟基双氯酚酸的RP-HPLC,该法能同时对代谢产物及双氯酚酸在CYP450 2C9酶孵育体系中代谢的酶动力学进行分析。
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