系统流路如图1所示。泵1和泵2分别输送HILIC和RPLC梯度洗脱和柱平衡流动相，初始条件下，阀1和阀2均处于实线位置，此时泵1与自动进样器、质谱相连，HILIC进行梯度洗脱、质谱分析，泵2进行RPLC柱平衡，HILIC梯度洗脱完成后，同时切换阀1和阀2均至虚线位置，使泵2与自动进样器、质谱相连，进行RPLC梯度洗脱、质谱分析，泵1对HILIC柱进行平衡，如此反复进行，质谱只获取HILIC和RPLC梯度洗脱周期的数据，解决了色谱柱平衡时间长的问题，分析通量大大提高。
图 1 单进样器HILIC/RPLC-MS/MS双模式交替分离系统流路示意图
色谱条件：
HILIC模式：采用ChromCore HILIC-ZW色谱柱(150 mm×3.0 mm, 3 μm)为HILIC分析柱，流动相A为乙腈，流动相B为50 mmol/L乙酸铵水溶液(甲酸调pH=3.0)，梯度洗脱(0~1 min，10%B；1~10 min，10%B~50%B；10~15 min，50%B)，色谱柱平衡(0~10 min，10%B)，流速为0.4 mL/min，色谱柱柱温为30 ℃，进样体积为5 μL。
RPLC模式：采用ChromCore AR C18色谱柱(150 mm×3.0 mm, 3 μm)为RPLC分析柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液，色谱柱平衡和梯度洗脱(0~17 min，95%B，17~19 min，95%B~ 60%B，19~24 min，60%B~ 0B，24~26 min，0B)，流速为0.4 mL/min，色谱柱柱温为30 ℃，进样体积为2 μL。
切换阀：阀 1，0 min (1-6)，15 min (1-2)，26 min (1-6)；阀 2，0 min(1-10)，15 min (1-2)；26 min (1-10)。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式；扫描模式：多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压：5500 V(正离子)、-4500V(负离子)；离子源温度：500 ℃；气帘气压力：241 kPa；雾化气压力：345 kPa；辅助气压力：379 kPa。14种代谢物和内标的质谱参数见表1。
表 1 14种代谢物和内标的质谱参数
序号 | 化合物 | 母离子 (m/z) | 子离子(m/z) | 去簇电压（V） | 碰撞能量（V） |
1 | 肌氨酸 | 90.1 | 44.2* | 20 | 16 |
90.1 | 72.1 | 20 | 16 | ||
2 | L-丙氨酸 | 90.1 | 44.2* | 20 | 16 |
90.1 | 72.1 | 20 | 16 | ||
3 | L-组氨酸 | 156.0 | 110.0* | 50 | 19 |
156.0 | 138.1 | 50 | 10 | ||
4 | 赖氨酸 | 147.1 | 84.0* | 40 | 20 |
147.1 | 130.1 | 40 | 15 | ||
5 | L-谷氨酸 | 148.0 | 84.0* | 40 | 20 |
148.0 | 130.0 | 40 | 15 | ||
6 | 胆碱 | 104.0 | 60.0* | 60 | 23 |
104.0 | 45.1 | 60 | 31 | ||
7 | 18:0 Lyso PC | 524.4 | 184.0* | 120 | 38 |
524.4 | 104.1 | 120 | 38 | ||
8 | 16:0 Lyso PE | 454.3 | 313.0* | 38 | 29 |
454.3 | 116.0 | 38 | 29 | ||
9 | L-亮氨酸 | 132.0 | 85.9* | 40 | 15 |
132.0 | 90.0 | 40 | 14 | ||
10 | L-苯丙氨酸 | 166.1 | 120.0* | 50 | 18 |
166.1 | 103.0 | 50 | 38 | ||
11 | α-酮戊二酸 | 144.9 | 100.9* | -27 | -11 |
144.9 | 57.0 | -27 | -16 | ||
12 | 富马酸 | 115.0 | 71.0* | -60 | -11 |
115.0 | 44.9 | -50 | -30 | ||
13 | 顺式乌头酸 | 172.9 | 84.9* | -20 | -17 |
172.9 | 111.0 | -20 | -12 | ||
14 | 琥珀酸 | 117.0 | 73.0* | -25 | -15 |
117.0 | 99.0 | -25 | -14 | ||
15 | 氯化胆碱-d4 | 108 | 58* | 60 | 35 |
108 | 60 | 60 | 35 |
* 定量离子
标准谱图
试剂及材料
甲醇、乙腈、异丙醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，德国Merck公司)；人工尿液(上海源叶生物科技有限公司)；1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0 Lyso PE)、1-十八酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(18:0 Lyso PC)标准品(德国Merck公司)，纯度＞99%；α-酮戊二酸、富马酸、顺式-乌头酸、琥珀酸、肌氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、胆碱等12个标准品均购自上海安谱实验科技有限公司，纯度均大于98%；内标氯化胆碱-d4(德国Merck公司)，纯度＞98%。
