镉胁迫对拟南芥幼苗形态生理和错配修复相关基因表达的影响研究

摘要：以拟南芥为供试材料，从形态指标、生理指标、分子指标3 个层次研究了镉（Cd）的毒理效应，筛选Cd 敏感生物标记物。分子指标的研究以18S rRNA 为看家基因，错配修复基因MutS 2 homolog（atMSH2），atMSH3，atMSH7，细胞增殖核抗原1 和2（atPCNA1 和atPCNA2）为检测目的基因，采用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术研究Cd 胁迫对上述错配修复相关基因表达的影响。结果表明，不同浓度（0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1）Cd 处理7 d 后，根长随Cd 胁迫强度的增加而降低；0.125 mg·L-1Cd 处理下，地上部可溶性蛋白含量显著增加，而在0.25、1.0 和3.0 mg·L-1 Cd 时降低，但仍高于对照；幼苗叶片数、地上部鲜重、叶绿素含量变化与对照相比差异均不显著。地上部atMSH2，atPCNA1，atPCNA2 基因表达量的变化与Cd 胁迫浓度呈明显的倒U 字型关系，分别在0.125，0.25 和0.125 mg·L-1 Cd 时达到最大值。以上结果表明，地上部可溶性蛋白含量变化与上述3 个错配修复相关基因表达量的改变趋势相符，且均对Cd 污染胁迫较敏感，可以作为检测Cd 污染及其相关生物学效应的潜在生物标记物。

    近年来，随着工农业生产的迅速发展，农田土壤中重金属污染日益严重。我国受重金属污染的耕地面积近2 000 万hm2，约占耕地面积的1/5，其中Cd 污染耕地占1.33 万hm2。Cd 由于其高移动性和高毒害性，在1984 年被联合国环境规划署列为“危害全球环境的化学物质和化学过程清单”的首位，并且由于Cd 的难降解性和高积累性，它可以通过急性或慢性毒性作用积累于生物体内，并通过食物链危及人类健康[1-2]，因此对Cd 污染土壤的早期诊断和生态风险评价已成为当前最受关注的环境问题之一[3]。
    DNA 是生命活动中最重要的遗传物质，在维护机体的正常功能上具有重要作用，但是极易受外界物理、化学等因素的影响产生损伤，从而引起细胞及机体的损害。细胞及机体则需要对各种损伤进行修复来抵御外界的各种损害。对机体损伤和修复进行检测需要依靠灵敏性高的生物标记物法[4]。生物标记物作为指示环境污染物暴露危害效应的生物信号，显示了分子水平的暴露-效应关系。在生物体中，各种DNA 损伤和修复机制均有各自特异性的因子和基因组，构成各自的生物标记物[5]。目前，生物标记物在各种DNA损伤和修复检测上的研究已成为一个很重要的研究方向受到很多研究者的重视[6]。
    DNA 错配修复（mismatch repair，MMR）是一种复制后的修复，它是机体中主要的修复途径之一。MMR基因在生物进化过程中是保守基因，它能特异性识别和修复DNA 复制过程中出现的碱基错配，维持DNA复制的精确性和基因组的稳定性。错配修复基因主要为MutHLS 系统，其中植物含有MutS 同系物（MSH2、MSH3、MSH6、MSH7）、MutL 同系物（MLH1）和PMS2等[7]。MSH2 蛋白与MSH6、MSH3 蛋白形成各自的异源二聚体，其复合物分别为MutSα 和MutSβ，分别在错配修复过程中对碱基-碱基错配起识别作用，并与错配位点结合，形成一种暂时性的复合物，从而启动错配修复，并与有关的酶配合切除含错配碱基的DNA 核苷酸序列[8]。
    MSH7 蛋白是植物中特有的、与MSH6 相似的、一种新发现的错配修复蛋白[11，13]。MSH6 和MSH7 在N-末端错配结合区域均含有带电荷的芳香残基，还含有N-末端相互作用区域，这些区域可能是与增殖细胞核抗原（PCNA）相互作用的位点[9]，PCNA 含量的变化与DNA 合成一致，是反映细胞增殖状态的生物标记物[10]。在生长旺盛的肿瘤组织中，PCNA 呈阳性表达，可作为原位检测肿瘤细胞增殖状态的生物标记物用于肿瘤动力学研究[8-10]。
    目前PCNA 和MMR 基因的研究主要集中在酵母[11-12]和人类细胞[8]，在植物方面的研究较少；有关植物PCNA 及MMR 基因的研究主要集中在紫外线、MMS 和H2O2 等胁迫条件[13]；重金属污染胁迫对植物PCNA 及MMR 基因表达的研究较少。本文以拟南芥为试验材料，采用半定量RT-PCR 技术探讨Cd 胁迫对拟南芥幼苗MMR 基因及PCNA 基因表达的影响，并与其形态及生理指标作比较，筛选出Cd 敏感生物标记物。旨在对环境中小剂量Cd 污染进行早期预警和诊断，为我国环境风险评价及土壤污染修复效果的质量评价提供科学的决策依据。