蜡蚧轮枝菌入侵蚧虫表皮过程中蛋白酶和几丁质酶的作用

摘 要 研究了蜡蚧轮枝菌两个菌株No. V3.4504和No. V3.4505感染沙里院褐球蚧的外观症状、入侵体壁的过程及胞外蛋白酶与几丁质酶的作用. 结果发现，用菌株No. V3.4504的孢子悬浮液感染蚧虫2 d后，在虫体表面蜡粉稀薄的位置和柔软的虫体腹面出现了菌丝，5 d后菌丝覆盖虫体，7 d后菌丝层加厚，虫体开始死亡. 显微切片观察，在体壁的外表皮、内表皮和真皮层都发现了菌丝，说明该菌已侵染成功. 以蚧虫的表皮为培养基对这两个菌株连续培养8 d，发现菌株No. V3.4504的蛋白酶活性在前6天连续上升，最大值为(33.94 ± 1.61) U/g，然后降低；几丁质酶活性在前期维持在一个较低水平，d 5开始增加，最大值为(7.28 ±1.36) U/g. 菌株No. V3.4505的蛋白酶和几丁质酶的活性变化趋势与No.V3.4504相似. 说明蛋白酶在菌丝侵染体壁的前期发挥了作用，降解表皮中的蛋白质，使几丁质暴露，诱导几丁质酶的大量产生，从而分解几丁质. 图3 表2 参22

    蚧虫在分类学上属于昆虫纲(Insecta)半翅目(Hemiptera)蚧总科(Coccoidea)，在全世界已记录20科约7 000余种，其中我国有700余种. 蚧虫分布广，寄主多，是林木、果树和观赏花卉的重要害虫，同时还危害牧草和农作物. 蚧虫的最大特点是虫体具有多种蜡腺，能分泌蜡质，在虫体表面形成厚蜡壳. 由于蜡壳的保护，蚧虫对外界不利条件的干扰具有很强的抵御能力，化学防治也很难奏效. 因此，开展以生物防治为主要手段的防治策略是实现可持续控制的重要途径. 生物防治包括应用天敌昆虫和病原微生物. 蚧虫在自然界中的病原菌相对较少，目前记录最重要的是蜡蚧轮枝
菌Verticillium lecanii (Zimm.)，它是一种虫生真菌，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科(Moniliaceae)轮枝菌属(Verticillium). 该菌最早由Nivter于1861年在锡兰发现寄生咖啡蜡蚧Lecanii coffeae，从上世纪以来，已在世界很多地方发现寄生蚧科(Coccidae)、盾蚧科(Diaspididae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、珠蚧科(Margarodidae)的30多种蚧虫[1, 2]. 但是，目前将蜡蚧轮枝菌主要用于防治蚜虫、粉虱和螨类[3~5]，而在蚧虫上的应用却很少[6, 7]. 在我国蜡蚧轮枝菌用于蚧虫的防治试验只有殷凤鸣等用该菌喷雾防治湿地松粉蚧Oracella acuta (Lobdell) [8]和袁盛勇用孢子悬浮液感染吹绵蚧Icerya purchasi Maskell的报道[9]. 上述研究都还局限于病原菌的调查记录和简单的防治试验，对于轮枝菌如何入侵蚧虫以及在入侵过程中该菌的蛋白酶和几丁质酶等胞外酶的作用和变化规律还未见报道，而这方面的研究对将蜡蚧轮枝菌成功应用于蚧虫的生物防治十分重要.
    虫生真菌通过体壁侵染致死昆虫的过程包括机械作用和酶的作用[10, 11]. 当真菌在穿透昆虫体壁的过程中能够分泌蛋白质酶、几丁质酶、脂酶、酯酶和淀粉酶等胞外酶[12~14]，其中蛋白酶对体壁的降解在影响侵入过程的因素当中被认为是最主要的，因为蛋白质是构成昆虫表皮的主要成份. 胞外蛋白酶能通过降解寄主表皮的蛋白质促进菌丝或孢子穿透寄主表皮，从而实现入侵. 冯明光等发现球孢白僵菌胞外蛋白酶与白僵菌对黑血蝗Melanoplus sanguinipes的毒力有着密切相关性，胞外蛋白酶与蝗虫死亡率的相关性可以达到0.67，据此提出用蛋白酶作为菌种毒力初期筛选的指标[15].几丁质酶能特异地催化水解几丁质的β-1,4-糖苷键生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)，直接参与几丁质的代谢过程，在虫生真菌侵染昆虫的过程中发挥重要的作用[16]. 几丁质酶通过降解昆虫表皮几丁质，使虫生真菌成功入侵昆虫表皮，同时降解的产物为真菌的生长提供营养.

    为了了解蜡蚧轮枝菌的蛋白酶和几丁质酶在该菌侵染蚧虫表皮过程中的作用，本文将蜡蚧轮枝菌两个菌株的孢子悬浮液去感染苹果树的重要蚧虫沙里院褐球蚧Rhodococcus sariuoni Borchsenius (蚧总科Coccoidea，蚧科Coccidae)雌成虫，观察虫体染菌后的外观症状，结合该蚧虫表皮的形态结构和化学成分，以蚧虫表皮为培养基，对这两个菌株进行培养，测定和比较了其蛋白酶和几丁质酶的活力变化，为揭示蜡蚧轮枝菌侵染蚧虫过程中这两种酶的作用机制提供科学
依据.