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关键词：
中药,物质基础,高效,分离,研究,
发表时间：
2010-11-26 11:17:28
摘要 以壳聚糖微球为载体、戊二醛(glutaraldehyde, GA)为交联剂对血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)进行固定化. 用固化的ACE 作为亲和介质, 利用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)与ACE 之间的亲和作用, 结合高效液相色谱对亲和前后的体系进行检测, 比较两者各组分色谱峰的差异, 以此实现快速筛选复杂体系中的ACE 抑制剂. 应用赖诺普利(Lisinopril)、九肽抑制剂、依那普利(Enalapril)、培哚普利(Perindopril)、卡托普利(Captopril)等已上市的ACEI 对方法进行验证, 反映方法具有高度选择性. 将方法应用于中药地龙及山楂筛选, 发现共有5 个组分与ACE 有亲和作用, 并且都能抑制ACE 酶活性, 它们对酶活性抑制的IC50 值在0.45~4.62 μg/mL 范围. 通过对亲和方法重现性考察, 6 次测定的相对标准偏差小于1%, 说明方法可靠. 提出的亲和色谱-色谱指纹差异法非常适合于从中药及天然产物等复杂混合物库中快速筛选靶点活性
物质.
物质.
中药的有效性毋庸置疑. 然而在近现代主流药学中, 中药仅扮演着配角角色, 根本原因在于药效物质基础不明. 中药药效物质的阐明对于中药的质量控制、新药研发及毒性控制有着重要意义[1~4]. 在高血压治疗中, 目前已知的具降压作用的中药有70 多种. 其中天麻、钩藤、菊花等可有效改善眩晕; 柴胡、龙胆草、地龙等可缓解急躁易怒; 山楂、五味子、柏子仁能改善心悸失眠等. 尽管作用各不相同, 但都有明确的降压作用. 探寻这些中药中的有效物质对于合理解释中药的作用机理、开发新型抗高血压药物有着明显意义.
血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是一种膜固定的二肽羧基金属蛋白酶,
在体内它能将血管紧张素I(十肽, Ang I)水解成血管紧张素II(八肽, Ang II), 而使得血管收缩, 引起血压升高. 目前, 血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensinconverting enzyme inhibitor, ACEI)是一类极为重要的高血压治疗药物. 但人工合成的ACEI 存在一些不良反应, 如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等. 因此从天然产物及中草药中筛选新的ACEI 将为高血压的治疗提供新的药物.
酶抑制剂的筛选方法主要被划分为两类：均相溶液酶法和固相酶法. 前者以溶液酶作为酶源, 在酶溶液中加入底物和抑制剂, 共同反应一段时间后, 通过检测溶液酶的活性, 来评估抑制剂对酶的抑制效果.后者将酶固定化, 制成酶柱或酶反应器, 通过检测酶与抑制剂特异性结合的效果, 来实现对酶抑制剂的筛选. 目前, ACEI 的筛选方法主要基于前者.
亲和色谱是利用生物分子间亲和吸附和解离来进行的一种分离方法, 分离过程具有高度的生物作用定向性; 近年来, 该法被广泛用于药物筛选研究[1,2,5~7], 并在天然产物活性成分筛选中体现出高效的特点. 在ACE 固定化方面, Megias 等[8,9]通过交联的方法, 将ACE 固定在琼脂糖表面, 以此作为亲和色谱填料, 从太阳花和油菜籽的蛋白水解液中提取出ACE 抑制肽. 孙凤祥等[10]用碳二亚胺为交联剂,将ACE 交联在壳聚糖上制成亲和色谱柱, 对猪骨胶原蛋白酶解物中的ACEI 进行分离纯化. Tang 等[11]将ACE 固定在毛细管内壁, 发展了一种在线检测ACEI活性的毛细管电泳法. 刘宏等[12]比较了包埋法和共价结合法对固化ACE 的影响, 其结果显示采用苯甲磺酰氯法固化ACE, 酶固相化效率高, 酶活性保留较好. 本课题组[13]将ACE 通过共价交联固定在壳聚糖糖珠表面, 获得了良好的稳定性和重复性; 高活力固定化ACE 的研究为ACEI 亲和色谱提供了基础.
本文在前期工作基础上, 以固定化血管紧张素转换酶做为亲和介质, 通过亲和吸附截留中药提取
液中部分组分, 在进行提取液指纹图谱比对后, 快速确定中药中对酶活性有抑制作用的组分. 该方法能从复杂成分中高效挖掘与靶点相互作用的组分, 是进一步纯化、分析、制备有抑制活性的目标组分等后续工作的基础.
血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是一种膜固定的二肽羧基金属蛋白酶,
在体内它能将血管紧张素I(十肽, Ang I)水解成血管紧张素II(八肽, Ang II), 而使得血管收缩, 引起血压升高. 目前, 血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensinconverting enzyme inhibitor, ACEI)是一类极为重要的高血压治疗药物. 但人工合成的ACEI 存在一些不良反应, 如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等. 因此从天然产物及中草药中筛选新的ACEI 将为高血压的治疗提供新的药物.
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亲和色谱是利用生物分子间亲和吸附和解离来进行的一种分离方法, 分离过程具有高度的生物作用定向性; 近年来, 该法被广泛用于药物筛选研究[1,2,5~7], 并在天然产物活性成分筛选中体现出高效的特点. 在ACE 固定化方面, Megias 等[8,9]通过交联的方法, 将ACE 固定在琼脂糖表面, 以此作为亲和色谱填料, 从太阳花和油菜籽的蛋白水解液中提取出ACE 抑制肽. 孙凤祥等[10]用碳二亚胺为交联剂,将ACE 交联在壳聚糖上制成亲和色谱柱, 对猪骨胶原蛋白酶解物中的ACEI 进行分离纯化. Tang 等[11]将ACE 固定在毛细管内壁, 发展了一种在线检测ACEI活性的毛细管电泳法. 刘宏等[12]比较了包埋法和共价结合法对固化ACE 的影响, 其结果显示采用苯甲磺酰氯法固化ACE, 酶固相化效率高, 酶活性保留较好. 本课题组[13]将ACE 通过共价交联固定在壳聚糖糖珠表面, 获得了良好的稳定性和重复性; 高活力固定化ACE 的研究为ACEI 亲和色谱提供了基础.
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