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关键词：
凝血VIII因子,重链变体,分泌,intein,蛋白质剪接
发表时间：
2012-07-23 09:52:02
引入糖基化位点和L303E_F309S突变促进intein介导的断裂凝血_因子剪
范江林 | -> | 751| 0| 0.933453MB |凝血VIII因子,重链变体,分泌,intein,蛋白质剪接
摘要: 作者最近证明intein 的蛋白质剪接技术可用于双载体转B 区缺失型FVIII (BDD-FVIII) 基因, 在此基础上, 本研究将具有促FVIII 分泌作用的L303E/F309S 双突变和B 结构域糖基化位点引入BDD-FVIII 重链,观察重链变体对intein 剪接的BDD-FVIII 蛋白分泌和活性的影响。用分别融合Ssp DnaB intein 的重链变体(DMN6HCIntN) 和轻链 (IntCLC) 基因共转染培养的293 细胞, 用ELISA 分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FVIII 蛋白量, 并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示, DMN6HCIntN 和IntCLC 共转基因细胞上清液中剪接BDD-FVIII 的浓度为 (149 ± 23) ng·mL−1, 活性为 (1.12 ± 0.14) u·mL−1, 明显高于intein 融合的野生型重链 (HCIntN) 与轻链 (IntCLC) 共转基因细胞 [(99 ± 14) ng·mL−1 和 (0.77 ± 0.13) u·mL−1], 提示重链变体能明显促进剪接BDD-FVIII 蛋白的分泌和活性; 另外, 还检测到不依赖细胞机制的BDD-FVIII 剪接。本研究为进一步动物体内双AAV 载体转BDD-FVIII 基因研究提供了依据。
甲型血友病占血友病的80%, 是由FVIII 质或量的缺陷导致的X 染色体联锁遗传性出血性疾病, 由
于属于单基因病、FVIII 的分泌性特点使转基因表达无需特定的靶细胞等, 基因治疗是其理想的疗法[1]。但相对于具有相似结构和大小的另一个凝血因子FV的高效分泌性, FVIII 的分泌非常低效, 影响转基因的表达水平和疗效[2]。另外, FVIII 的基因较大, 难以为有众多优点的腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体转运[3]。目前解决AAV 容量限制的策略之一是采用双载体分别转运FVIII 的重链和轻链基因, 由翻译后的重链和轻链多肽分泌过程中形成功能性异源二聚体出胞发挥凝血活性[4, 5], 但重链多肽的分泌效率远低于轻链多肽, 导致链不均衡性问题, 不仅使分泌的功能性二聚体水平降低, 过多的重链多肽淤积于细胞会使细胞不稳定, 甚至会诱导凋亡[6]。作者最近运用intein 的蛋白质反式剪接技术进行的双载体共转B 区缺失型FVIII (BDD-FVIII) 的重链和轻链基因研究证明, 轻链不仅可顺式促进重链多肽的分泌, 而且intein 催化剪接反应可由细胞分泌的intein
融合重链和轻链前体多肽在培养上清液中进行, 表明其不依赖细胞机制[7, 8]。Intein 是包埋在蛋白质前体中的多肽序列, 翻译后通过其自催化作用在蛋白质水平将其自身切除并伴随两侧宿主蛋白以肽键相连,此作用类似于RNA 剪接被称为蛋白质剪接作用[9]。Intein 蛋白质剪接的高效、精确、肽键无缝连接以及不依赖细胞机制等特点, 使其作为一种有力工具在蛋白质工程和药物开发如体内外多肽的连接、多肽环化、蛋白质纯化、生物传感器及基因治疗等研究中得到应用[10, 11]。研究表明, 干扰FVIII 与内质网分子伴侣蛋白BiP 结合的重链A1 区点突变L303E/F309S 可将FVIII 的分泌性提高3 倍[12]; B 区的糖基化可通过促进FVIII 分泌过程由内质网向高尔基体的转运促进FVIII 分泌[13]。本研究将B 区6 个糖基化位点和A1区L303E/F309S 突变引入BDD-FVIII 的重链, 用双载体共转融合intein 的重链变体和轻链基因至培养的293 细胞, 考察剪接BDD-FVIII 蛋白分泌量和活性,为进一步运用intein 的双AAV 动物体内转基因研究提供实验依据。
于属于单基因病、FVIII 的分泌性特点使转基因表达无需特定的靶细胞等, 基因治疗是其理想的疗法[1]。但相对于具有相似结构和大小的另一个凝血因子FV的高效分泌性, FVIII 的分泌非常低效, 影响转基因的表达水平和疗效[2]。另外, FVIII 的基因较大, 难以为有众多优点的腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体转运[3]。目前解决AAV 容量限制的策略之一是采用双载体分别转运FVIII 的重链和轻链基因, 由翻译后的重链和轻链多肽分泌过程中形成功能性异源二聚体出胞发挥凝血活性[4, 5], 但重链多肽的分泌效率远低于轻链多肽, 导致链不均衡性问题, 不仅使分泌的功能性二聚体水平降低, 过多的重链多肽淤积于细胞会使细胞不稳定, 甚至会诱导凋亡[6]。作者最近运用intein 的蛋白质反式剪接技术进行的双载体共转B 区缺失型FVIII (BDD-FVIII) 的重链和轻链基因研究证明, 轻链不仅可顺式促进重链多肽的分泌, 而且intein 催化剪接反应可由细胞分泌的intein
融合重链和轻链前体多肽在培养上清液中进行, 表明其不依赖细胞机制[7, 8]。Intein 是包埋在蛋白质前体中的多肽序列, 翻译后通过其自催化作用在蛋白质水平将其自身切除并伴随两侧宿主蛋白以肽键相连,此作用类似于RNA 剪接被称为蛋白质剪接作用[9]。Intein 蛋白质剪接的高效、精确、肽键无缝连接以及不依赖细胞机制等特点, 使其作为一种有力工具在蛋白质工程和药物开发如体内外多肽的连接、多肽环化、蛋白质纯化、生物传感器及基因治疗等研究中得到应用[10, 11]。研究表明, 干扰FVIII 与内质网分子伴侣蛋白BiP 结合的重链A1 区点突变L303E/F309S 可将FVIII 的分泌性提高3 倍[12]; B 区的糖基化可通过促进FVIII 分泌过程由内质网向高尔基体的转运促进FVIII 分泌[13]。本研究将B 区6 个糖基化位点和A1区L303E/F309S 突变引入BDD-FVIII 的重链, 用双载体共转融合intein 的重链变体和轻链基因至培养的293 细胞, 考察剪接BDD-FVIII 蛋白分泌量和活性,为进一步运用intein 的双AAV 动物体内转基因研究提供实验依据。
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