抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测

摘 要 建立了一种以SYBR Green I为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法. 以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料，通过使用特异性引物和SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测，绘制了两种基因扩增的标准曲线图，根据标准曲线方程计算外源基因含量；并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析. 研究发现，两者标准曲线方程线性关系良好，R2值分别达到0.993 9与0.992 4. 通过已知标准品进行验证，实测值与真值接近，与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%. 结果表明，SYBR Green I结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测. 图5 表2 参11

    随着转基因技术的日趋成熟，各种转基因农作物由实验室走向环境释放，其中不少农作物已进行商品化生产，且种植面积急剧扩大. 根据国际农业生物技术应用咨询服务中心（ISAAA）2007年的报告，95%的转基因农作物集中在大豆、玉米、棉花和油菜籽4种植物上，抗各种杂草和抗虫害的两个转基因类型占主导地位. 由此带来的转基因生物及产品的安全性问题已经成为人们讨论的热点问题. 世界多数国家和国际组织的普遍做法是对转基因产品实施标识管理，大部分实施转基因产品标识管理政策的国家都规定了各自不同的标识阈值. 例如：欧盟（2002）规定转基因产品成分高于
0.9%，巴西为4%，澳大利亚和新西兰为1%，俄罗斯、中国香港和中国台湾地区都为5%时，就必须进行标识. 我国2001年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》，其中第四章第二十八条明确规定，在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物，应当有明显的标识.因此，为转基因产品实施标签制度的定量检测技术显得尤为重要.
    近年来，对转基因生物产品进行定量分析的主要方法是荧光定量PCR技术. 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性强和灵敏度高的特点，避免了PCR产物进行后期处理，克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点[1]，极
大地提高了检测速度和自动化程度. 荧光定量PCR技术是指在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法. 荧光定量PCR的荧光基团包括探针类和染料类两种. 本文所用染料类如SYBR Green I是一种非饱和菁类荧
光素，利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，其处于游离状态时，检测不到荧光信号，当结合dsDNA后荧光强度明显增强，即被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板量相关. 目前实时荧光定量PCR中使用特异性的荧光探针较多，但由于反应体系中荧光探针能与靶序列特异性杂交，同时存在猝灭不彻底、合成和标记复杂、成本较高等缺陷[2~4]. SYBR Green I荧光染料成本较低，但尚未在定量检测转抗除草剂基因作物中应用. 为了降低检测成本，本研究利用SYBR Green I荧光染料代替价格昂贵的TaqMan探针进行定量检测，分别建立了两种商品化程度最高的转基因大豆CP4-EPSSPS和转基因玉米（TC1507）PAT两种抗除草剂基因的定量PCR检测体系，以期为我国转基因定量标识检测体系提供技术支持.