基于巯基_烯点击反应制备有机_无_省略_亲和整体柱用于糖蛋白的选择性富集

摘要: 发展了以巯基-烯点击反应制备有机-无机杂化硼酸亲和整体柱的新方法。首先以四甲氧基硅烷( TMOS) 和巯丙基三甲氧基硅烷( MPTMS) 作为反应单体，采用溶胶-凝胶反应制备表面含巯基的硅胶整体柱。然后利用巯基-烯( thiol-ene) 的点击反应在整体柱上修饰硼酸配基3-丙烯酰胺基苯硼酸( AAPBA) ，制成AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱。对影响硼酸亲和整体柱性能的条件如TMOS 与MPTMS 的比例、聚乙二醇和甲醇的用量等进行了优化。并采用扫描电镜、红外光谱等分析仪器对整体柱形貌和机械稳定性能进行了表征。研究了AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱的分离性能，结果表明，其在中性条件下对含有顺式二醇的生物小分子核苷具有良好的特异亲和能力，并已成功地应用于卵清蛋白、辣根过氧化物酶等糖蛋白的分离。基于巯基-烯反应的制备方法新颖、可靠，可用于制备多种不同类型的硼酸亲和整体柱，具有较大的应用前景。

    糖蛋白是一类重要的翻译后修饰蛋白，它是由糖链在多肽链上以多种形式共价修饰而成的一类重要的生理活性物质。糖蛋白在生物体内种类繁多，分布广泛，与人体中很多重要的生物学过程密切相关［1，2］。因此，对糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值。通常糖蛋白在复杂生物体系中的绝对丰度都非常低，高丰度的非糖蛋白的存在会对低丰度的糖蛋白产生干扰和掩盖。虽然生物质谱技术得到了迅速的发展，但是对于低丰度的糖蛋白或糖肽的分析还是无能为力，为了解决这一瓶颈问题，多种糖蛋白或糖肽的分离富集技术应运而生［3 － 6］。在复杂的生物体系中，通过选择性地分离、富集低丰度糖蛋白来排除高丰度非糖蛋白的干扰是目前糖蛋白鉴定和研究的有效策略。近几年来，硼酸亲和技术在糖蛋白分离富集领域得到了快速的发展。硼酸亲和作用的机理是硼酸基团在碱性条件下与带有顺式二醇( cis-diol) 基团的物质共价结合，形成稳定的五或六元环酯结构，当介质的pH 切换为酸性时则可实现可逆的解离［7］。利用硼酸这种可逆结合的性质，硼酸亲和技术已发展成为一种选择性富集含顺式二醇基团化合物的有效提纯手段。
    整体柱作为一种新型分离介质，具有制备简单、通透性好、传质快等优点，在生物分离分析中发挥的作用日益增大［8，9］。将整体柱与硼酸亲和技术相结合，是当前硼酸亲和材料的一个发展方向。硼酸亲和整体柱结合了整体柱材料与硼酸亲和技术的优点，近年来受到了很大关注［10］。2006 年Potter等［11］首先在毛细管中合成了硼酸亲和整体柱，并在微液相色谱模式和毛细管电色谱模式下实现了核苷类物质的分离、富集。Chen 等［12］采用3-丙烯酰胺基苯硼酸作为功能单体原位聚合制备了有机基质硼酸亲和整体柱，并将其作为一种固相微萃取柱用于萃取核苷和糖蛋白，扩展了硼酸亲和整体柱的应用范围。Liu 等［13 － 16］研究了一系列苯硼酸衍生物为功能单体合成可在中性条件下工作的硼酸亲和整体柱，为硼酸亲和整体柱的设计和制备提供了更多选
择。随后Lin 等［17］和Liu 等［18］利用“一锅法”［19， 20］制备了有机-无机杂化硼酸亲和整体柱，将新的整体柱载体引入硼酸亲和技术中，制备的硼酸亲和整体柱显示了优良的性能。
    在色谱分离领域，Cu( I) 催化叠氮-炔基环加成反应( Cu ( I ) -catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC) ［21］作为典型的点击化学反应已应用于液相色谱固定相的制备中［22］。我们采用CuAAC 反应制备疏水聚合物整体柱［23， 24］和硼酸有机-无机杂化硼酸亲和整体柱［25］，并成功用于蛋白质的分离。巯基-烯( thiol-ene) 反应是另一类典型的点击化学反
应。巯基-烯点击反应不需要加入催化剂，不会在产物中造成重金属残留，在光引发或热引发的条件下即可快速反应。利用其制备色谱固定相，具有制备简单、反应条件温和、可控性好等优点，可形成具有特殊交联网状结构的聚合物，在聚合物材料的制备中受到越来越多的关注［26］。
    本文采用溶胶-凝胶和巯基-烯点击反应两步制备有机-无机杂化硼酸亲和整体柱，建立了一种制备硼酸亲和整体柱的新路线。首先以四甲氧基硅烷( TMOS) 和巯丙基三甲氧基硅烷( MPTMS) 作为反应单体，采用溶胶-凝胶反应制备表面含巯基的硅胶整体柱。然后利用巯基-烯反应在整体柱上修饰硼酸配基3-丙烯酰胺基苯硼酸( AAPBA) ，制成AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱，并成功用于含顺式二醇的核苷和糖蛋白的分离。相比“一锅法”路线［17， 18］，本方法先合成带有活性位点的整体骨架材料，再通过点击反应将硼酸配基接枝到整体柱上。所得材料的功能基团均分布在骨架表面，避免了功能基团被包埋在骨架中的问题，更利于其与目标分子作用。并且所得的骨架中间体可以用于接枝不同性质和功能的硼酸基团，从而可以用于制备多种类型的硼酸亲和整体材料。