_卡拉胶寡糖为配体的亲和探针制备方法的研究

摘要 目的: 建立一种以J- 卡拉胶寡糖为配体, Affi- ge l 15为载体的亲和探针, 用于分离纯化J- 卡拉胶寡糖在细胞信号通路中的特异性受体。方法: 将标准寡糖和J- 卡拉胶寡糖进行己二胺衍生化后与Affi- ge l 15结合, 并利用M S、NMR、PAGE电泳等方法对各步的产物进行分析。结果: M S、NMR结果表明, 标准寡糖和J - 卡拉胶寡糖均能与己二胺进行完全稳定的衍生化反应, 其衍生物与A ffi- g el 15的结合率都能达到50%以上, 其中J - 卡拉胶寡糖- 己二胺与Affi- gel 15的结合率达到了68%。结论: 制备得到的以J- 卡拉胶寡糖为配体的亲和探针能够与J- 卡拉胶寡糖的受体结合, 如碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)。这表明这种制备方法是可行的。

    作为生物体信号传递过程中的重要组成部分,很多寡糖在抗病毒、病原菌抑制、增强免疫力、改善胃肠功能等方面都发挥了重要作用[ 1 ~ 6 ] 。研究发现, 很多多糖降解后得到的寡糖比原来的多糖具有更明显的生理活性和更少的副作用。例如, 由甲壳素脱乙酰化、降解后得到的壳寡糖具有许多甲壳素所不具备的优异的生理功能, 如提高机体的免疫能力和抗癌能力, 改善肠道微生物的区系分布, 刺激有益菌的生长[ 7, 8] ; 经化学降解后的肝素寡糖与肝素相比, 其药理学分布曲线得到了改善, 表现出更好的抗血栓活性和其他生物药效, 并且减少了副作用[ 9] 。基于寡糖类物质在生物活性研究中得到越来越多的实例验证, 阐明寡糖物质的作用机理已经成为当前糖生物学研究的核心问题。
    研究表明, 寡糖的生物活性是通过与细胞中多种蛋白质因子的相互作用来实现的, 因此, 通过制备亲和探针来寻找寡糖在细胞中的蛋白质靶点已逐渐成为一种有效的研究寡糖生理功能的分子机制的方法。在以糖为配体的亲和探针的制备及其应用方面, 国内外对肝素/肝素寡糖的报道较多, 较常见的制备方法是利用肝素/肝素寡糖分子链上丰富的可反应基团, 如羟基、羧基、磺酸基、氨基等与亲和色谱基质上可反应基团进行反应, 以共价键的方式将之固定于基质上或人为的再在基质与肝素/肝素寡糖之间接上一/空间臂0 (如六碳以上的二胺)以提高肝素/肝素寡糖分子的自由性[ 10~ 12] 。利用这种亲和色谱的方法, 人们证实并且提纯了多种能与肝素/肝素寡糖相互作用的蛋白质。例如, N ascimento 等人利用肝素- 琼脂糖亲和色谱证实了组织蛋白酶X( cathepsin X )与肝素的相互作用[ 13] ; 穆成华等人将环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶胺化后与肝素反应制备得到肝素亲和层析介质, 并用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶Ó [ 14 ] 。
   J- 卡拉胶是由B- D - 4 - 硫酸- 半乳糖( Galp4S)和A- D - 3, 6- 内醚半乳糖( A3, 6G alp)形成的交替共聚物, 经过降解得到的J- 卡拉胶寡糖作为一种海洋硫酸寡糖, 来源丰富、结构独特而且与内源性寡糖有很多相似点, 有着巨大的开发潜力, 其结构和功能都与肝素寡糖或硫酸肝素寡糖相似。本实验室的前期研究发现, 卡拉胶寡糖能够抑制血管的生成从而阻止肿瘤的生长[ 15] 。因此, 在上述研究的基础上, 本实验建立了一种制备以J- 卡拉胶寡糖为配体的亲和探针的方法, 以期用于筛选细胞中J- 卡拉胶寡糖的靶标蛋白, 为研究卡拉胶生物活性的分子机理提供更加明确的实验依据。