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关键词：
黑松,美味牛肝菌,根际,菌根辅助细菌,蜡状芽孢杆菌
发表时间：
2013-12-06 10:24:53
稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建
蒋丽杰 | -> | 675| 0| 1.128371MB |XYL1,XYL2,重组酿酒酵母,木糖,乙醇
摘 要 分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2，构建出重组表达质粒pACT2-xyl1和pDR195-xyl2，并使其分别转化酿酒酵母受体细胞. 酶活测定结果显示，转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达. 并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆，进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5-kanR-x12，以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中，得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株. 图3表1 参15
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是工业上生产乙醇的优良菌株，较之细菌，具有较高的乙醇耐受力，对木质纤维素水解液中的抑制物也有较高的抗性[1]. 纤维素原料经预处理后有很大一部分半纤维素降解成木糖，虽然酿酒酵母以其高效的产乙醇能力和较强的乙醇耐受性成为目前广泛使用的乙醇生产菌， 但由于它们都不能利用木糖，故用作木质纤维素乙醇生产菌的优势并不明显[2].
木糖在木质纤维素水解产物中含量可高达30%，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高25%，从而大大降低生产成本[3]. 酿酒酵母不能利用木糖，但能利用其异构体木酮糖，所以构建利用木糖产乙醇的酿酒酵母代谢工程菌株的重要策略之一是在酿酒
酵母细胞中克隆并表达天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，即木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2.目前，被人们研究最多、最具工业应用前景的可发酵木糖产乙醇的酵母菌有3种, 即嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus) 、树干毕赤酵母( Pichia stipitis)和休哈塔假丝酵
母(Candida shehatae) [4]. 目前，国内外主要将天然利用木糖产乙醇的树干毕赤酵母(P. stipitis)的木糖还原酶基因 (XYL1)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)在酿酒酵母中进行活性表达，
并以此为基础继续进行改造而使其能够利用木糖产乙醇.
木糖在木质纤维素水解产物中含量可高达30%，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高25%，从而大大降低生产成本[3]. 酿酒酵母不能利用木糖，但能利用其异构体木酮糖，所以构建利用木糖产乙醇的酿酒酵母代谢工程菌株的重要策略之一是在酿酒
酵母细胞中克隆并表达天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，即木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2.目前，被人们研究最多、最具工业应用前景的可发酵木糖产乙醇的酵母菌有3种, 即嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus) 、树干毕赤酵母( Pichia stipitis)和休哈塔假丝酵
母(Candida shehatae) [4]. 目前，国内外主要将天然利用木糖产乙醇的树干毕赤酵母(P. stipitis)的木糖还原酶基因 (XYL1)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)在酿酒酵母中进行活性表达，
并以此为基础继续进行改造而使其能够利用木糖产乙醇.
本文克隆了同样可以利用木糖产乙醇的休哈塔假丝酵母(C.shehatae)的木糖还原酶基因以及热带假丝酵母(C. tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因，使其在酿酒酵母中强化表达并测定了相应的酶活水平. 之后，又将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆，连接到酵母染色体整合载体YIp5-kanR上，构造出重组染色体整合质粒YIp5-kanR-x12，以期今后通过转化此整合质粒将基因XYL1、XYL2整合到发酵性能良好的酿酒酵母Y5基因组中，从而得到能够稳定发酵葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.
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