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关键词：
籽粒苋,镉,植物修复,耐性,重金属,超富集植物
发表时间：
2013-12-12 10:23:08
转座子挽救法克隆鞘氨醇单胞菌CDS_1中呋喃丹水解酶相关基因
冯玲儿 | -> | 688| 0| 1556.491MB |Sphingomonas agrestis CDS-1,呋喃丹,转座子挽救法,基因克隆
摘 要 用含Tn5转座子的自杀性质粒pSC123诱变呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1，获得失去呋喃丹降解功能的突变株CDS-M1. 以pMD18-T为载体在E. coli DH5α中构建了CDS-M1的基因组文库，采用转座子挽救法对Tn5插入位点两侧翼的序列进行克隆与测序，根据测序结果（共4 551个碱基）设计引物，从CDS-1的基因组中扩增到同样大小的片段，把该片断克隆到广宿主载体pPZP201上，得到重组质粒pCDZ1，通过三亲接合的方法把pCDZ1导入CDS-M1中进行功能互补实验，结果显示CDS-M1的呋喃丹水解功能得到了恢复，表明该片断中包含呋喃丹水解酶相关基因. 图7表1 参14
呋喃丹作为一种高效的氨基甲酸酯农药，曾经在防治农作物的害虫方面发挥了巨大的作用，该农药主要是通过抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶而杀死害虫[1~2]. 由于乙酰胆碱酯酶在脊椎动物中普遍存在，而且呋喃丹水溶性好，半衰期长，因此会对非靶标生物产生潜在威胁[3~4]. 目前，已从Achromobacter sp.、Sphingomonas sp.、Pseudomonas sp.等属中分离到降解这类农药的微生物[5~9]，但是仅从Achromobactersp. WM111克隆到呋喃丹水解酶基因. 本实验室从长期受呋喃丹污染的污泥中分离到一株能矿化呋喃丹的菌株，命名为Sphingomonas agrestis CDS-1 [10]. 该菌株首先把呋喃丹降解成呋喃酚，然后再进一步降解呋喃酚至二氧化碳和水. 呋喃丹降解为呋喃酚由呋喃丹水解酶催化. 由于没有合适的方法区分呋喃丹和呋喃酚，所以很难通过基因文库法克隆呋喃丹水解酶基因. 本研究利用转座子插入突变法[11]，首先获得突变株，然后建立突变子基因组文库，通过转座子挽救法和功能互补的方法克隆呋喃丹水解酶相关基因.
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关键词： Sphingomonas agrestis CDS-1,呋喃丹,转座子挽救法,基因克隆 发表时间： 2013-12-12 10:21:40