地衣芽孢杆菌生麦芽糖_淀粉酶的基因克隆与鉴定

摘 要 以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM，克隆入表达载体pET-28a(+)，转化Escherichia.coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导，测定麦芽糖淀粉酶酶活性. 结果表明，麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达，酶活力为3.797 U/mL，SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×103的特异性蛋白质条带. 酶学性质分析表明，重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45 ℃，最适反应pH为6.5，在45 ℃以下的中低温环境保持稳定，且能在比较宽的pH范围内(pH 4.5~8.5)稳定. 图3 表1 参16

    生麦芽糖α-淀粉酶(Maltogenic α-amylase，MAase)，俗称麦芽糖淀粉酶，全称1,4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖基水解酶[1,4-α-D-glucan α-maltohydrolase，EC 3.2.1.133]，是一类水解α-1,4-D-葡萄糖苷键的内切淀粉酶，作用于淀粉及相关多聚糖、寡糖，产物为α-麦芽糖. 麦芽糖单位从淀粉链的非还原末端按顺时针方向被水解下来[1]. 麦芽糖淀粉酶与环状麦芽糊精淀粉酶、新普鲁兰酶(Neopullulanase)和Thermoactinomyces vulgarisⅡ型淀粉酶同属于淀粉分解酶类亚族GH13[2~5].
    麦芽糖淀粉酶非常独特，不同于典型的淀粉酶，它不但可快速水解利用直链淀粉或环状糊精，也能少量利用支链淀粉[6~8]，具有多底物特性；而且还具有转糖基作用[1]. 另外，麦芽糖淀粉酶还能水解阿卡波糖(Acarbose，一种α-淀粉酶的有效抑制剂)，但这与菌种相关[2]. 麦芽糖淀粉酶基因主要来源于芽孢杆菌和放线菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、栖热菌属、嗜热放线菌等.麦芽糖淀粉酶作为一种新型的酶制剂，主要用于淀粉及食品烘焙工业：在食品行业中，由于其独特的抗老化作用，可用于延长焙烤食品的货架期；在淀粉行业，可单独或与一种支链淀粉脱支酶一起用于生产高麦芽糖浆.
    目前，国外关于微生物来源的麦芽糖淀粉酶的研究已经向分子生物学水平深入进行，Kim Do Yeon等将一株Bacillus subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶基因在B. subtilis168 中表达并对其启动子功能进行研究[1]；Park K H等研究了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶的转糖基作用方
式与机理[2]；Liu Bin等对来源于深海嗜热芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶基因进行克隆并在E. coil中与谷胱苷肽S-转移酶实现融合表达[5]；Aubrey Jones等对Bacillus sp. TS-25来源的麦芽糖淀粉酶进行了分子进化方面的研究[9]. 但国内相关研究几乎是空白. 随着酶工业的不断发展以及人们对麦芽糖质量的更高要求，应用酶制剂生产麦芽糖浆已成为研究的热点.国外几家大型酶制剂公司已有麦芽糖淀粉酶面世，但价格昂贵；而国内基本靠进口，大大增加了生产成本. 所以麦芽糖淀
粉酶作为一种较新的酶制剂，有必要对其加以深入系统的研究. 本文报道了地衣芽孢杆菌来源的生麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆和异源表达，并对重组酶的酶学性质及水解淀粉产物进行了系统的分析.