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关键词：
展示,南极,酵母,脂肪,酵母,细胞,催化,合成,芳香,
发表时间：
2010-12-02 13:22:57
乙肝表面抗原结合蛋白SBP在毕赤酵母中的表达纯化及功能鉴定
生物 | -> | 1047| 0| 1.624002MB |乙肝,表面,抗原,结合,蛋白,酵母,表达,纯化,功能,鉴定,
摘 要: 乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein, SBP)是本实验室发现的一种人源蛋白, 该蛋白与人乙型肝炎病毒HBV 表面抗原HBsAg 存在特异性的结合能力。此前的研究证实SBP 具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。为进一步研究该蛋白的生理功能和作用机制, 利用毕赤酵母表达系统进行了SBP 的表达菌株构建, 筛选得到了SBP 的高效表达菌株。发酵产物经过分离纯化, 最终得到了大量高纯度的真核来源的目的蛋白。通过SDS-PAGE、高效液相色谱、Westernblotting 和质谱鉴定, 证实所得到的蛋白具有较高的纯度和完整性。通过ELISA 方法初步证实了其与乙肝表面抗原具有较好的结合能力。该研究为进一步进行SBP 的体内外功能研究及免疫增效研究打下了基础。
乙型病毒性肝炎(Hepatitis B, HB)是一种严重危害人类健康的传染性疾病, 全世界约有3.5 亿HBV慢性携带者[1], 我国更是乙肝高流行区, 约有1.2 亿携带者[2], 接种乙肝疫苗是预防感染乙型肝炎和降低乙肝病毒携带率的最有效的措施[3]。但是, 乙肝疫苗的免疫效果个体差异很大, 正常人群中有5%~10%的个体在按标准程序接种乙肝疫苗后不能产生足够的抗体以抵抗乙肝病毒的感染[4]。因此, 寻找一种能够有效增强乙肝疫苗免疫原性的分子来强化机体的应答反应具有非常重要的现实意义。HBV外膜蛋白是识别人肝细胞质膜可能受体的重要分子, 它决定了HBV 对宿主细胞的靶向和最初的侵染过程[4]。本实验室在前期工作中, 以乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)为探针, 通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA 噬菌体表达库中筛选出1 株编码乙肝表面抗原结合蛋白的cDNA 克隆。该cDNA 具有独立的开放阅读框架, 编码1 个由344 个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子,蛋白同源性分析表明该蛋白与免疫球蛋白重链具有高度同源性, 应当属于免疫球蛋白超家族成员, 暂命名为乙肝病毒表面抗原结合蛋白(HBV surfaceantigen binding protein, SBP, GenBank Access No.AY570731)[5]。
前期的研究工作中, 在原核蛋白表达系统中成功表达了该蛋白。Western blotting 和ELISA 实验表明原核SBP 蛋白具有与HBsAg 特异性结合的能力;流式细胞实验证实, 基因工程表达的HBV-SBP 蛋白可以显著增强肝癌细胞株HepG2 对乙肝表面抗原的亲和力[5]; 将乙肝疫苗和SBP 一起注射小鼠发现其诱导产生HBsAg 特异性抗体的水平较对照明显提高,证实其具有针对乙肝疫苗的免疫增效作用[6]。然而, SBP 是一个人源蛋白。原核表达来源的SBP 不可避免地与其天然形式存在着差异, 包括高级结构的差异和氨基酸残基的糖基化修饰等。因此,要进一步研究SBP 的功能和作用机理, 必须获得正确折叠和糖基化的真核来源的SBP。
真核生物毕赤酵母(Pichia pastoris)近年来被广泛应用于蛋白质表达和纯化, 具有蛋白质的糖基化修饰能力, 比原核表达的蛋白在结构上更为接近天然构象。并且表达量高, 遗传稳定, 操作方便, 是理想的真核蛋白表达系统。目前毕赤酵母已经广泛应用于各种蛋白的生物工程生产, 有着很好的应用前景[7]。因此, 结合本室课题的研究, 希望利用毕赤酵母进行SBP 的真核表达, 为进一步研究其功能打下基础, 同时也为今后可能对SBP 进行大规模工业化生产和应用提供前期准备。
前期的研究工作中, 在原核蛋白表达系统中成功表达了该蛋白。Western blotting 和ELISA 实验表明原核SBP 蛋白具有与HBsAg 特异性结合的能力;流式细胞实验证实, 基因工程表达的HBV-SBP 蛋白可以显著增强肝癌细胞株HepG2 对乙肝表面抗原的亲和力[5]; 将乙肝疫苗和SBP 一起注射小鼠发现其诱导产生HBsAg 特异性抗体的水平较对照明显提高,证实其具有针对乙肝疫苗的免疫增效作用[6]。然而, SBP 是一个人源蛋白。原核表达来源的SBP 不可避免地与其天然形式存在着差异, 包括高级结构的差异和氨基酸残基的糖基化修饰等。因此,要进一步研究SBP 的功能和作用机理, 必须获得正确折叠和糖基化的真核来源的SBP。
真核生物毕赤酵母(Pichia pastoris)近年来被广泛应用于蛋白质表达和纯化, 具有蛋白质的糖基化修饰能力, 比原核表达的蛋白在结构上更为接近天然构象。并且表达量高, 遗传稳定, 操作方便, 是理想的真核蛋白表达系统。目前毕赤酵母已经广泛应用于各种蛋白的生物工程生产, 有着很好的应用前景[7]。因此, 结合本室课题的研究, 希望利用毕赤酵母进行SBP 的真核表达, 为进一步研究其功能打下基础, 同时也为今后可能对SBP 进行大规模工业化生产和应用提供前期准备。
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