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关键词：
奥运会,可吸入颗粒物(PM10,PM215),形貌特征,生物活性,北京
发表时间：
2012-08-10 08:42:51
白腐真菌细胞色素P450的诱导及检测方法研究
张雯雯 | -> | 761| 0| 0.235806MB |白腐真菌,细胞色素P450,诱导,CO结合差光谱,细胞破碎
摘要: 以CO 结合差光谱为基本检测法, 研究了白腐真菌黄孢原毛平革菌中细胞色素P450 的诱导和适宜的分离检测方法. 结果表明, 正己烷对该真菌P450 有显著的诱导作用, P450 诱导量受正己烷浓度和诱导时间的影响, 每小时投加正己烷2 LLPmL、诱导6 h 可使该真菌微粒体P450 比浓度高达140~ 160 pmolPmg . 在此基础上, 本研究优化了分离P450 时破碎细胞的方法以及光谱法检测P450 的条件. 破碎细胞时, 采用高速分散结合玻璃研磨, 比采用玻璃研磨、超声破碎和珠磨等方法分离的微粒体P450含量高1~ 5 倍, 是更为适宜的破碎方法. 检测CO 结合差光谱时, 通气和还原条件对P450 检测值有显著影响, 较适宜的条件为: 样品池和对照池分别通入等量的CO 和N2 , 通气流量为3 mLPmin( 300 LL 样本) , 通气时间40 s; 通气后投加还原剂低亚硫酸钠, 投加浓度为014 molPL.
白腐真菌是一类可降解木质素、营腐生生活的白色丝状真菌, 多数属于担子菌纲. 白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium) 对多环芳烃、多氯联苯、二英等许多有机污染物都有明显的降解功能[ 1] , 其降解酶系和作用机制是环境微生物领域的热点问题. 细胞色素P450( 简称P450)是一类含有高铁血红素Ù 的多功能氧化酶, 普遍存在于各类生物中, 参与代谢各种外源污染物、药物以及激素等物质[ 2, 3] . 黄孢原毛平革菌拥有150 多个功能未知的P450 基因[ 4] , 是迄今所知的P450 基因最丰富的真菌. 基因水平的研究和P450 抑制剂试验的结果表明, 该真菌的P450 很可能参与降解多环芳烃、农药等许多有机污染物[ 5~ 11] , 具有突出的研究价值. 但是, 目前对其降解功能的明确结论却很少, 直接分离该真菌P450 酶液的研究仅鉴定了苯并( a) 芘羟化功能[ 12] . 限制着白腐真菌P450 研究的重要原因是真菌P450 分离检测困难.
P450 含量检测既是环境毒理学分析的重要手段, 也是P450 降解功能、酶学性质等蛋白质层次研
究的基础[ 3] . 在动物P450 的研究中, 最常用的检测方法是CO 结合差光谱法, 检测时对还原剂浓度和通气量等条件不需要非常严格地限定也能有较稳定的结果. 检测前的分离过程一般采用玻璃研磨等较温和的细胞破碎方法, 能够控制住P450 的失活. 但是对于白腐真菌, 由于细胞不易破碎、P450 相对含量较低而且分离到胞外后很容易失活[ 12] , 其P450含量分析难以采用通常的破碎方法和检测条件, 而各种破碎方法和不同检测条件对白腐真菌P450 的影响还缺乏系统的研究, 适宜的方法尚未见详细的报道, 这使分离检测成为白腐真菌P450 研究的瓶颈问题.
本研究的目的就是突破这一瓶颈, 在有效提高P450 含量的基础上明确适合于白腐真菌P450 的分
离检测方法. 因为正己烷对多种微生物的P450 都有明显的诱导作用, 而且诱导产生的P450 具有多样的功能, 被称作P450 的多功能诱导剂[ 13] , 所以本研究采用正己烷诱导白腐真菌P450, 并在优化的诱导条件下获得了较高P450 含量的菌体; 在此基础上, 首次较系统地研究了不同分离方法和各个检测条件对白腐真菌P450 检测结果的影响, 明确了白腐真菌P450 适宜的分离检测方法.
P450 含量检测既是环境毒理学分析的重要手段, 也是P450 降解功能、酶学性质等蛋白质层次研
究的基础[ 3] . 在动物P450 的研究中, 最常用的检测方法是CO 结合差光谱法, 检测时对还原剂浓度和通气量等条件不需要非常严格地限定也能有较稳定的结果. 检测前的分离过程一般采用玻璃研磨等较温和的细胞破碎方法, 能够控制住P450 的失活. 但是对于白腐真菌, 由于细胞不易破碎、P450 相对含量较低而且分离到胞外后很容易失活[ 12] , 其P450含量分析难以采用通常的破碎方法和检测条件, 而各种破碎方法和不同检测条件对白腐真菌P450 的影响还缺乏系统的研究, 适宜的方法尚未见详细的报道, 这使分离检测成为白腐真菌P450 研究的瓶颈问题.
本研究的目的就是突破这一瓶颈, 在有效提高P450 含量的基础上明确适合于白腐真菌P450 的分
离检测方法. 因为正己烷对多种微生物的P450 都有明显的诱导作用, 而且诱导产生的P450 具有多样的功能, 被称作P450 的多功能诱导剂[ 13] , 所以本研究采用正己烷诱导白腐真菌P450, 并在优化的诱导条件下获得了较高P450 含量的菌体; 在此基础上, 首次较系统地研究了不同分离方法和各个检测条件对白腐真菌P450 检测结果的影响, 明确了白腐真菌P450 适宜的分离检测方法.
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