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关键词：
UVPH2O2,微囊藻毒素-LR,降解
发表时间：
2012-07-31 15:21:31
pUCD_recA重组发光菌构建及对遗传毒性污染物响应作用
马晓敏 | -> | 1322| 1| 0.269539MB |重组发光菌,遗传毒性,pUCD-recA载体,响应效应
摘要: 基因重组发光菌在水质毒性的评价中具有重要的作用, 本研究从分析污染物毒性损伤的机制出发, 构建新型pUCD- recA基因重组发光菌. 用PCR 法从大肠杆菌W3110 中扩增recA 基因, 将其与pGEM-T easy 载体连接后测序. 测序正确的recA 片段及pUCD615 载体均用BamH Ñ 、EcoRÑ 双酶切, 连接后电转化导入宿主菌JM109. 挑取克隆, 提取质粒用PCR 鉴定, 阳性克隆再进行测序. 将构建成功的pUCD- recA 载体转化入大肠杆菌RFM443, 加入相应的遗传毒性污染物, 观察发光响应作用. 结果表明, recA 基因PCR 扩增出的片段为293 bp, 测序结果与GenBank 中的recA 序列进行BLAST 比对, 同源性为99%, 表明扩增序列正确. 与pUCD615 载体连接后的测序结果表明, recA 基因已正确地插入到pUCD615 的多克隆位点, 方向和读码框正确, 重组发光菌载体构建成功. 将构建好的重组载体转化入RFM443 宿主菌, 加入遗传毒性污染物观察响应效果. 丝裂霉素C( MMC) 对pUCD- recA 重组发光菌诱导效果最好, 01 01 mgPL即可有很好的响应曲线; Nc- 甲基-Nc- 硝基亚硝基胍(MNNG) 则在50~ 100 mgPL时可发挥最佳响应作用.
工业化的深入发展对环境带来的危害日趋严重. 为保障水环境的安全, 加强水质毒性监控尤为紧
迫. 以发光细菌检测水质污染是目前国际上广泛认可而又较为先进的生物检测手段之一. 然而野生发
光菌直接用来检测水质污染却存在诸多限制, 如对毒性物质特异性差、不易定性、培养条件苛刻导致发光不稳定等. 随着分子生物学的发展, 国外许多研究机构纷纷尝试对发光菌进行改造[ 1~ 4] , 通过基因工程技术将lux 发光基因系统中的结构基因融合到特定的启动子下游, 导入其他非发光宿主细胞后, 形成重组发光细菌. 可以快速测定化学物质及环境污染物的毒性, 确定环境污染的程度以及进行环境质量的评价.
在这些重组菌中尤以诱导型重组发光细菌受到越来越广泛的关注. 来自美国、以色列的Van Dyk、
Vollmer 和Belkin 等[ 5~ 9], 从20 世纪90 年代初即开始重组发光菌的研究, 构建了一系列重组发光细菌,用于毒物检测. 2000 年, 以DNA 损伤为目标, 研究者进一步优化了基因融合和调控技术[ 10] . 韩国学者Mitchell 等[ 11] 构建了容纳双质粒的重组发光细菌, 用于同时检测具有遗传毒性和氧化性损伤的污染.
遗传毒性污染物由于其巨大危害而备受关注,对这类污染物的识别和评价尤为重要. 本研究从污
染物遗传毒性损伤的机制出发, 针对我国特定的水质条件和环境条件来构建遗传毒性新型基因重组发
光菌. recA 是与细菌的DNA 损伤修复调控相关的基因, 其启动子属于强启动子. 质粒pUCD615 是一种
经多次改造的载体[ 12] , 在原先pUCD5B 载体的基础上插入部分pUC19 的多克隆位点, 并插入luxCDABE全基因盒. 多克隆位点便于插入各类启动子, 以满足不同的检测需求. 该质粒具有氨苄青霉素、卡那霉素双抗性, 且宿主范围宽, 有利于重组体的筛选. 正常生理状况下, 下游lux 基因的表达受到抑制; 当具有遗传毒性的物质存在时, DNA 受损产生的单链DNA将激活蛋白, 解除阻遏蛋白的抑制, 使下游的lux 基因在recA 的强启动作用下得以表达, 发出荧光.
迫. 以发光细菌检测水质污染是目前国际上广泛认可而又较为先进的生物检测手段之一. 然而野生发
光菌直接用来检测水质污染却存在诸多限制, 如对毒性物质特异性差、不易定性、培养条件苛刻导致发光不稳定等. 随着分子生物学的发展, 国外许多研究机构纷纷尝试对发光菌进行改造[ 1~ 4] , 通过基因工程技术将lux 发光基因系统中的结构基因融合到特定的启动子下游, 导入其他非发光宿主细胞后, 形成重组发光细菌. 可以快速测定化学物质及环境污染物的毒性, 确定环境污染的程度以及进行环境质量的评价.
在这些重组菌中尤以诱导型重组发光细菌受到越来越广泛的关注. 来自美国、以色列的Van Dyk、
Vollmer 和Belkin 等[ 5~ 9], 从20 世纪90 年代初即开始重组发光菌的研究, 构建了一系列重组发光细菌,用于毒物检测. 2000 年, 以DNA 损伤为目标, 研究者进一步优化了基因融合和调控技术[ 10] . 韩国学者Mitchell 等[ 11] 构建了容纳双质粒的重组发光细菌, 用于同时检测具有遗传毒性和氧化性损伤的污染.
遗传毒性污染物由于其巨大危害而备受关注,对这类污染物的识别和评价尤为重要. 本研究从污
染物遗传毒性损伤的机制出发, 针对我国特定的水质条件和环境条件来构建遗传毒性新型基因重组发
光菌. recA 是与细菌的DNA 损伤修复调控相关的基因, 其启动子属于强启动子. 质粒pUCD615 是一种
经多次改造的载体[ 12] , 在原先pUCD5B 载体的基础上插入部分pUC19 的多克隆位点, 并插入luxCDABE全基因盒. 多克隆位点便于插入各类启动子, 以满足不同的检测需求. 该质粒具有氨苄青霉素、卡那霉素双抗性, 且宿主范围宽, 有利于重组体的筛选. 正常生理状况下, 下游lux 基因的表达受到抑制; 当具有遗传毒性的物质存在时, DNA 受损产生的单链DNA将激活蛋白, 解除阻遏蛋白的抑制, 使下游的lux 基因在recA 的强启动作用下得以表达, 发出荧光.
丝裂霉素C( MMC) 、Nc-甲基-Nc-硝基亚硝基胍(MNNG) 为2 种重要的遗传毒性污染物, 本试验旨在分析pUCD-recA 重组菌对这2 种物质的响应作用.
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