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关键词：
嗜水气单胞菌脱色酶基因(tpmD),三苯基甲烷染料,希瓦氏菌启动子,无诱导表达
发表时间：
2013-02-03 16:34:34
三苯基甲烷类染料氧化酶基因_tpmD_在大肠杆菌中的无诱导表达
杜亿枫 | -> | 1454| 0| 1.036859MB |嗜水气单胞菌脱色酶基因(tpmD),三苯基甲烷染料,希瓦氏菌启动子,无诱导表达
摘要: 为了解决嗜水气单胞菌DN322 对鱼类的潜在致病性问题, 有必要克隆表达该菌的三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD. 通过PCR 方法获得该基因, 并与脱色希瓦氏菌S12 的NAD( P)H 脱氢酶基因启动子和用于荧光标记的编码CCPGCC 的碱基序列融合, 将有启动子和无启动子的融合基因片段分别连接到质粒pMD18-T 中, 转化大肠杆菌E. coli DH 5A和E. coli BL21. 结果发现, 有启动子的融合基因能被E. coli在不加诱导物IPTG 的条件下高效正确表达, 脱色酶活性甚至超过基因供体菌DN322. 将上述两株大肠杆菌工程菌株在自然水体中进行孔雀石绿污染小试处理, 60 d内在每个350mL反应体系中累积共投加大于10000mg的孔雀石绿, 脱色率一直保持在92%以上; 细菌数量最后增加了5 ~ 10倍. 研究结果证明, 基因工程菌在不加营养物的条件下也有很强的脱色活性和长期的存活能力; 在tpmD 基因3. 端加入的用于螯合双砷荧光染料的18bp编码氨基酸碱基序列不影响此基因的表达和酶的脱色活性, 这将赋予此工程菌可示踪性.
三苯基甲烷类染料孔雀石绿及其脱甲基代谢产物无色孔雀石绿因具有高毒性、高残留、高致癌、高致畸、致突变等作用而引起了世人的广泛关注(任随周等, 2006a). 鉴于孔雀绿在自然环境中难以
降解并且能够在动物体内长期残留, 如何消除孔雀绿在环境中的残留污染已成为迫在眉睫的问题.
菌株DN322是任随周等( Ren et al. , 2006)从活性污泥中分离到的一株嗜水气单胞菌新功能菌,
其对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料都能高效降解, 对底物具有结构专
一性(任随周, 2006a); 其降解酶(命名为tpmD )能够裂解三苯基甲烷类染料骨架结构, 是一种新发现
的细菌氧化酶, 其编码的基因已经被测序(任随周,2006b) . 该菌株对三苯基甲烷类染料高效脱色的功
能对于解决染料和染色废水处理工程中脱色的难题具有很高的应用价值, 但由于嗜水气单胞菌对鱼、蛙类具有潜在的致病性从而限制了该菌株在环境生物修复中的广泛应用. 因此, 很有必要探讨在水处理的生物强化过程中实现既能有效利用tpmD氧化酶的独特脱色降解功能、又能避开嗜水气单胞菌的潜在致病性的分子生物学技术途径.
本研究采用来自脱色希瓦氏菌S12的NAD( P)H 脱氢酶基因启动子序列SNDPromoter与嗜水气单胞菌DN322编码的三苯基甲烷类染料降解脱色酶tpmD 的基因相融合构建能够在无诱导条件下高效表达tpmD 酶的基因工程菌. 此外, 在tpmD 基因的3. 端加入了可螯合双砷荧光染料的CCPGCC 编码碱基, 考察此融合基因的表达与降解脱色活性; 并将该基因工程菌用于净化养殖水体孔雀石绿污染的小试实验.
降解并且能够在动物体内长期残留, 如何消除孔雀绿在环境中的残留污染已成为迫在眉睫的问题.
菌株DN322是任随周等( Ren et al. , 2006)从活性污泥中分离到的一株嗜水气单胞菌新功能菌,
其对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料都能高效降解, 对底物具有结构专
一性(任随周, 2006a); 其降解酶(命名为tpmD )能够裂解三苯基甲烷类染料骨架结构, 是一种新发现
的细菌氧化酶, 其编码的基因已经被测序(任随周,2006b) . 该菌株对三苯基甲烷类染料高效脱色的功
能对于解决染料和染色废水处理工程中脱色的难题具有很高的应用价值, 但由于嗜水气单胞菌对鱼、蛙类具有潜在的致病性从而限制了该菌株在环境生物修复中的广泛应用. 因此, 很有必要探讨在水处理的生物强化过程中实现既能有效利用tpmD氧化酶的独特脱色降解功能、又能避开嗜水气单胞菌的潜在致病性的分子生物学技术途径.
本研究采用来自脱色希瓦氏菌S12的NAD( P)H 脱氢酶基因启动子序列SNDPromoter与嗜水气单胞菌DN322编码的三苯基甲烷类染料降解脱色酶tpmD 的基因相融合构建能够在无诱导条件下高效表达tpmD 酶的基因工程菌. 此外, 在tpmD 基因的3. 端加入了可螯合双砷荧光染料的CCPGCC 编码碱基, 考察此融合基因的表达与降解脱色活性; 并将该基因工程菌用于净化养殖水体孔雀石绿污染的小试实验.
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