新型糖组成高效液相色谱分析技术的构建及其在水飞蓟多糖质控中的应用

摘要: 本研究采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (PMP) 作为还原醛糖的标记识别分子, 利用高效液相色谱-紫外检测器 (HPLC-UV) 和普通C18 色谱柱, 建立了10 种常见单糖在13.5 min 内的快速HPLC-UV 分析鉴别技术,并成功地用于植物药水飞蓟多糖中单糖的组成分析。结果表明, 醛糖的PMP 标记与流动相三乙胺 (TEA) 配比分离调节相结合, 可大幅度调节系列单糖PMP 标记物的分离度, 具有很高的分离可控性; 水飞蓟多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖及阿拉伯糖8 种单糖组成, 其摩尔比为0.66∶0.84∶0.58∶1.0∶1.6∶0.69∶2.7∶4.8; 样品测定回收率为92.4%～104.0%。该方法简单、快速、准确, 可用于水飞蓟多糖的有效质量控制。

    糖类广泛存在于植物中, 具有重要的生物功能和药用价值[1−3]。近年来, 随着蛋白与核酸研究的深入, 随着糖类参与组织细胞功能活动机制的阐明, 随着糖类特殊药用价值的凸现, 丰富了人们对糖类的认识[1, 4]。目前, 国内外已报道了100 多种天然聚糖,其中95%以上为植物多糖和寡糖, 其生物活性除了具有膳食纤维清除毒素、控制食量、平衡脂肪和稳定血糖的作用外, 药理作用还涉及免疫调节、抗辐射、抗凝血、抗肿瘤、抗HIV 病毒等[5]。由于聚糖具有毒副作用小、使用安全等突出优点, 近年来多糖和寡糖类药物和功能食品得到迅速发展。
    多糖和寡糖的基本单糖组成结构是构成其重要药理活性的基础, 而植物中的次生代谢产物也多以糖苷的形式存在, 并发现其糖基部分对糖苷 (黄苷、蒽醌苷、苯丙素苷、三萜苷、皂苷、强心苷、糖肽、糖蛋白等) 的代谢、吸收及生物活性产生重要的影响[3]。因此, 如何高效分离鉴别常见单糖, 对糖类药品食品的质量控制以及糖苷类药物的间接糖组成质量控制具有重要意义, 是亟待发展的技术。天然糖苷成分类型多样、结构复杂、单体分离鉴别困难, 目前大多数该类有效成分对照品严重缺乏, 已成为制约中药质量控制的“瓶颈”[6]。同时, 同一种苷元的糖苷因连接的单糖种类和数量的差异, 使高效的色谱分离测定也难于进行, 经常有错误的鉴定[7]。因此, 糖苷类
药物中糖含量的间接控制值得探索。目前, 糖类质量控制主要采用传统的苯酚-硫酸比色法测定总糖含量,但是, 对于不同类型多糖, 特别是对于与蛋白质、色素等杂质结合的结合型多糖的总糖含量测定, 其准确度很低。因此, 发展多糖和寡糖的各组成单糖含量与比例的准确鉴定技术极为迫切[8−11]。
    多糖是中药材的主要基质成分, 通常由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等10 种还原单糖中的部分单糖或全部单糖构成。值得注意的是, 单糖因存在互变异构、差向异构及结构相似等特征, 所以糖类分析有其自身的特点, 必须具有高效的分离技术, 因而一直是挑战药物分析科学领域的国际难题[1, 12−14]。在糖类的分析中, HPLC 具有高效、稳定且普通实验室可配置等突出特征被视为理想的分析技术。但是, 在现有的色谱分离技术条件下, 通常只实现6～8 种单糖的基线分离[15−18], 明显影响质控的准确性。为此, 本研究在前期研究的基础上, 采用PMP 作为还原醛糖的标记分子, 通过对缓冲液组成、有机胺的配比比例、梯度模式等分离参数的系统优化, 构建了10 种常见还原单糖的HPLC 快速、准确分离鉴别模式, 并成功应用于中药水飞蓟多糖的糖组成质量控制。