新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制剂细胞水平评价体系的建立

摘要: 本文旨在建立以2009 新型甲型H1N1 流感病毒神经氨酸酶 (neuraminidase, NA) 为靶点的神经氨酸酶抑制剂 (neuraminidase inhibitors, NAIs) 细胞水平评价体系。NA 有促进流感病毒释放的作用, 本研究应用重组病毒技术, 通过将表达NA [A/California/04/2009 (H1N1)] 的质粒、表达流感病毒血凝素蛋白HA (hemagglutinin)的质粒以及表达敲除外壳基因并带有荧光素酶报告基因的HIV-1 基因组共转染至病毒生成细胞, 产生以HA、NA 为外壳蛋白包裹HIV-1 核心的重组病毒。在病毒释放前加入不同浓度的化合物, 收集病毒上清液感染细胞,通过测定感染率来反映化合物对重组病毒NA 的抑制作用。经用阳性对照药物奥司他韦及其羧酸盐证实本模型能够反映化合物对病毒NA 的抑制作用; 在此基础上, 本研究还建立了奥司他韦耐药株评价模型。本研究所建立的体系可用于针对新型甲型H1N1 流感病毒及其临床耐药株神经氨酸酶抑制剂的寻找和评价。

    流感病毒可引起急性呼吸道传染病, 每年造成死亡人数达25 万～50 万[1]。2009 年3～4 月, 一种新型甲型H1N1 流感病毒出现于北美[2], 并在不到3 个月的时间席卷全球, 成为40 年来首次世界大流行疾病, WHO 于6 月11 日将警戒级别升至6 级。截至2009 年12 月16 日, 我国内地累计报告110 590 例甲型H1N1 流感确诊病例, 死亡442 例[3]。针对该病毒,WHO 推荐药物为奥司他韦 (oseltamivir) 和扎那米韦(zanamivir)[4], 均为神经氨酸酶抑制剂 (neuraminidase inhibitors, NAIs)。但是伴随药物的广泛使用, 流感病毒已在药物选择压力下出现耐药现象[5, 6], 并有扩散趋势, 因此寻找新型的针对甲型H1N1 流感病毒的神经氨酸酶抑制剂迫在眉睫。
    目前评价NAIs 的方法为酶活性检测法, 即以唾液酸类似物为底物与神经氨酸酶作用, 检测酶催化产物, 以反映药物对神经氨酸酶活性的影响[7−9]。值得注意的是, 流感病毒NA 的功能是在病毒释放环节切割病毒血凝素蛋白HA (hemagglutinin) 与细胞表面唾液酸SA (sialic acid) 的结合, 从而使病毒得以释放[10], 因此流感病毒NA的天然底物是宿主细胞表面与病毒血凝素蛋白相连接的多形式糖基化的唾液酸。所以建立细胞水平神经氨酸酶抑制剂评价系统,可以更确切地反映细胞病理条件下NAIs 的作用。神经氨酸酶H274Y 或H275Y 突变是引起流感病毒对奥司他韦耐药的决定性因素[11], 此次新型流感的奥司他韦临床耐药病例经检测也是由于病毒神经氨酸酶H275Y 位点变异引起的[5, 6]。因此, 建立奥司他韦耐药型神经氨酸酶评价体系, 对于寻找针对该新型流感的抑制剂意义重大。重组病毒技术是一项可用于多种人类高致病性病毒研究的成熟技术, 重组流感病
毒的应用也多有报道[12, 13], 本研究即采用此技术,构建了表达新型甲型流感神经氨酸酶 (野生型/达菲耐药型) 的重组流感病毒, 此体系可用于药物筛选和评价。