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关键词：
胶州湾,倾倒区,沉积物,重金属,生态风险
发表时间：
2012-08-28 08:25:26
基于PMA_定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究
于波 | -> | 1169| 1| 388.013MB |PMA染料,定量PCR,活性菌,氯消毒,一氯胺消毒,灭活特性
摘要:建立了一种核酸染料propidium monoazide( PMA) 与定量PCR 技术联合选择性检测活性病原菌的技术( PMA-qPCR) ，以大肠杆菌作为模式菌，研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性. 结果表明，PMA 染料能够分别去除99. 94% 和99. 99% 的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA，PMA-qPCR 技术能够有效区分活性菌与非活性菌;PMA-qPCR 技术得到的氯和一氯胺消毒对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程，灭活速率常数分别为2. 24 L·(mg·min) － 1 和0. 017 5 L·(mg·min) － 1 ，低于平板培养法得到的灭活速率常数;当大肠杆菌的去除率达到99% 时，采用PMA-qPCR 技术检测需要的ct 值相比于平板培养法从0. 6 mg·L － 1·min上升到0. 9 mg·L － 1·min( 氯消毒) 和从20 mg·L － 1·min上升到超过100 mg·L － 1·min( 一氯胺消毒) ;随着ct值的升高，常规qPCR 的检测结果基本不变，因此常规qPCR 不能够反映氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果. 作为一种新的表征消毒特性的检测技术，PMA-qPCR 技术有助于更为准确地评价氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.
消毒技术是饮用水供给、污水处理以及再生水回用中灭活病原菌的核心环节，而对活性病原菌消毒效果的准确评价是保障水质卫生安全的重要基础. 传统的消毒效果的评价主要基于培养法，该方法以细菌的可培养性作为细菌活性的判断标准. 但细菌在消毒剂存在的不利条件下可能进入“具有活性但无法培养”( viable but not culturable，VBNC) 的状态，致使某些病原菌无法在平板培养基上形成菌落但仍然保持一定代谢能力，能够在适宜条件下恢复其感染性［1 ～4］，因此基于该分析技术不能够准确反映消毒技术对活性病原菌的灭活效果.
目前国际上对细菌活性尚没有统一的定义.Nebe-von-Caron 等［5］的研究表明，细胞膜受损的细菌不具有代谢活性，不能够在适宜的条件下恢复生长，因此采用细胞膜的完整性作为细菌活性的判断标准为许多研究者所接受［6，7］. PMA ( propidium monoazide) 是一种能够选择性进入细胞膜破损的非活性菌细胞内部的核酸染料，其能够与非活性菌的DNA 共价结合并抑制其PCR 反应，使得定量PCR( qPCR) 只能够检测到细胞膜完整的活性菌，而无法检测到细胞外DNA 和细胞膜破损的非活性菌［8，9］.因此，PMA 染料与qPCR 结合的检测技术( PMAqPCR)既可以实现对进入VBNC 状态病原菌的检测，又在一定程度上解决了常规qPCR 无法区分活性菌和非活性菌的不足. 目前，PMA-qPCR 技术已开始用于选择性检测大肠杆菌等多种病原菌的活性菌［8 ～ 16］，但采用该技术针对不同消毒剂消毒特性的研究却鲜有报道.
鉴于此，本研究首先考察了PMA-qPCR 技术针对水环境中2 种典型病原菌大肠杆菌和沙门氏菌选择性检测活性菌的效果，然后采用PMA-qPCR 技术研究了氯消毒和一氯胺消毒2 种常见消毒方式对病原菌的灭活特性，综合比较了PMA-qPCR、平板培养法以及常规qPCR 等不同检测技术评价消毒效果的差异，探讨了基于PMA-qPCR 分析技术的消毒机制，以期为更准确地评价不同消毒工艺对病原菌的灭活效果提供新的数据支持. 由于大肠杆菌( Escherichiacoli)被广泛用于消毒特性的研究［17 ～ 19］，因此本研究采用大肠杆菌作为研究消毒特性的模式菌.
目前国际上对细菌活性尚没有统一的定义.Nebe-von-Caron 等［5］的研究表明，细胞膜受损的细菌不具有代谢活性，不能够在适宜的条件下恢复生长，因此采用细胞膜的完整性作为细菌活性的判断标准为许多研究者所接受［6，7］. PMA ( propidium monoazide) 是一种能够选择性进入细胞膜破损的非活性菌细胞内部的核酸染料，其能够与非活性菌的DNA 共价结合并抑制其PCR 反应，使得定量PCR( qPCR) 只能够检测到细胞膜完整的活性菌，而无法检测到细胞外DNA 和细胞膜破损的非活性菌［8，9］.因此，PMA 染料与qPCR 结合的检测技术( PMAqPCR)既可以实现对进入VBNC 状态病原菌的检测，又在一定程度上解决了常规qPCR 无法区分活性菌和非活性菌的不足. 目前，PMA-qPCR 技术已开始用于选择性检测大肠杆菌等多种病原菌的活性菌［8 ～ 16］，但采用该技术针对不同消毒剂消毒特性的研究却鲜有报道.
鉴于此，本研究首先考察了PMA-qPCR 技术针对水环境中2 种典型病原菌大肠杆菌和沙门氏菌选择性检测活性菌的效果，然后采用PMA-qPCR 技术研究了氯消毒和一氯胺消毒2 种常见消毒方式对病原菌的灭活特性，综合比较了PMA-qPCR、平板培养法以及常规qPCR 等不同检测技术评价消毒效果的差异，探讨了基于PMA-qPCR 分析技术的消毒机制，以期为更准确地评价不同消毒工艺对病原菌的灭活效果提供新的数据支持. 由于大肠杆菌( Escherichiacoli)被广泛用于消毒特性的研究［17 ～ 19］，因此本研究采用大肠杆菌作为研究消毒特性的模式菌.
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